黄芪多糖对H2O2所致乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的影响

沈玉珏

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)



黄芪多糖对H2O2所致乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的影响

沈玉珏

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

[摘要]目的研究黄芪多糖对H2O2所致乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的影响，并探讨其可能作用机制。方法分离并培养乳鼠心肌细胞72 h后分为空白对照组、H2O2组、黄芪多糖20 μmol/L+H2O2组、黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组、黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组，每组设10个复孔。每组给予相应干预24 h后，采用MTT法检测细胞存活率，采用紫外-可见分光光度计检测细胞中抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)]活性，采用氧敏感荧光探针DCFH-DA检测氧自由基(ROS)含量，采用全自动生化分析仪检测培养液中心肌酶[谷草转氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)]和丙二醛(MDA)含量，通过流式细胞仪检测细胞凋亡状况并计算凋亡率，采用免疫印迹法检测细胞核因子-κB(NF-κB)蛋白表达情况并进行半定量分析。结果与H2O2组比较，黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组和黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组细胞存活率及细胞中SOD、GSH-Px、CAT活性显著升高(P均<0.05)，ROS含量显著降低(P<0.05)，培养液中AST、CPK、LDH和MDA含量及细胞凋亡率、NF-kB蛋白表达量均显著降低(P均<0.05)；黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组细胞存活率及细胞中SOD、GSH-Px活性均显著高于黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组(P均<0.05)，CPK、MDA含量及细胞凋亡率、细胞中NF-κB蛋白表达量均显著低于黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组(P均<0.05)。结论黄芪多糖可能通过提高心肌细胞存活率、改善抗氧化酶活性、提高ROS清除能力、降低心肌酶含量、抑制细胞凋亡、下调NF-kB蛋白表达而对H2O2诱导乳鼠心肌细胞氧化应激损伤起保护作用，且高剂量效果更好。

[关键词]黄芪多糖；H2O2；心肌细胞；氧化应激

心肌细胞缺血再灌注损伤是影响急性心肌梗死患者溶栓、介入手术等手段治疗效果的重要因素之一，其病理机制非常复杂，其中氧化应激损伤是最重要的病理基础之一[1]，为研发抑制缺血再灌注损伤的新型药物提供了新的思路。黄芪多糖是我国传统中药黄芪的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤等多种药理学作用[2-5]。本研究观察了黄芪多糖对H2O2所致乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的影响，并探讨了其可能作用机制，现将结果报道如下。

1实验资料

1.1药物与试剂黄芪多糖，西安沃森生物科技有限公司，批号：20131205； DMEM培养基、胎牛血清，美国Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)、甲基四唑蓝(MTT，美国Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)检测试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司；谷草转氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；氧自由基(ROS) 检测试剂盒、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞核因子-κB(NF-κB)单克隆抗体，碧云天生物技术有限公司。

1.2实验动物清洁级雄性SD乳鼠(1～3 d)，购自河北省实验动物中心，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003，动物合格证号：150314012。

1.3主要仪器SW-4T-2F洁净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂； NU-4850E型CO2培养箱，美国Nu Aire公司；VCX750型超声波细胞破碎仪，美国SONICS公司；UV762型紫外-可见分光光度计，上海楚定分析仪器有限公司；BS-300型全自动生化分析仪，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；iMark型酶标仪、FACS Aria型流式细胞仪，美国BD公司；DYY-11 型多用电泳仪、JY-SCZ2电泳槽，北京六一仪器厂。

1.4乳鼠心肌细胞的分离、培养与分组参照文献[6]方法，无菌环境下开胸取心脏并剪取心室组织，剪碎，加入0.1%胰酶后于37 ℃振荡消化6 min，去上清、沉淀，继续用0.1%胰酶于37 ℃振荡消化6 min，如此循环直至组织碎块消化完毕，收集消化上清液，1 500 r/min离心10 min，取沉淀，加入心肌细胞培养基(10%胎牛血清 DMEM，内含105IU/L的青霉素和链霉素)，吹打均匀，壁立 1.5 h。收集未贴壁细胞，调整细胞至 6×108L-1，接种于35 mm培养器皿中，37 ℃、5% CO2、100%湿度培养72 h后，将状态良好的原代乳鼠心肌细胞随机分为空白对照组、H2O2(200 μmol/L)组、黄芪多糖20 μmol/L+H2O2组、黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组、黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组，每组设10个复孔，给予相应干预。

1.5检测指标

1.5.1细胞存活率干预24 h后，将细胞接种于96孔培养板(n=6)，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h后弃上清，每孔加入150 μL DMSO振荡15 min，通过酶标仪检测490 nm处OD值，然后计算细胞存活率：细胞存活率(%)=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。

1.5.2细胞中SOD、GSH-Px、CAT活性干预24 h后，弃培养基取细胞，每孔加入2 mL PBS溶液后冰浴中破碎处理30 s，低温离心取上清液，通过紫外-可见分光光度计平行测定各组细胞裂解液中SOD、GSH-Px、CAT活性。

1.5.3细胞中ROS含量去培养液，加入氧敏感荧光探针DCFH-DA(10 μmol/L)，置于细胞培养箱内孵育20 min后，经无血清细胞培养液冲洗3次，然后通过荧光显微镜和流式细胞仪进行检测。

1.5.4培养液中AST、CPK、LDH和MDA含量干预24 h后，分别取各组培养液并按照各试剂盒操作方法进行处理，然后通过全自动生化分析仪平行测定各组细胞培养液中AST、CPK、LDH含量，并紫外-可见分光光度计测定各组培养液中MDA含量。

1.5.5细胞凋亡情况及细胞凋亡率干预24 h后，使用0.25%胰酶进行消化，离心弃上清液，经PBS溶液冲洗2次后，按照AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒操作方法步骤依次进行处理，避光孵育10 min后采用流式细胞仪检测，观察各组细胞凋亡状况并在流式二维图中计算凋亡率。

1.5.6细胞中NF-κB蛋白表达情况取1.5.2制备的细胞裂解提取液，经12 000 r/min低温离心10 min后取沉淀，行BCA法蛋白定量，变性后上样，经电泳、转膜、春红溶液染色后，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(NF-κB，β-actin)4 ℃过夜；洗膜，二抗室温摇床上孵育1 h后经ECL显色，实验结果应用Quantity One软件进行分析。

1.6统计学方法运用软件SPSS 17.0进行统计分析。计量资料用表示，组间均数比较采用One-way ANOVA进行分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1各组心肌细胞存活率比较空白对照组心肌细胞存活率为(96.8±4.6)%，H2O2组为(45.1±5.9)%，黄芪多糖20 μmol/L+H2O2组为(50.7±6.8)%，黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组为(68.4±7.5)%，黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组为(84.0±10.3)%。H2O2组乳鼠心肌细胞存活率明显低于空白对照(P<0.05)；黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组和黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组细胞存活率明显高于H2O2组(P<0.05)，黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组细胞存活率明显高于黄芪多糖40 μmol/L+ H2O2组(P<0.05)。

2.2各组心肌细胞中SOD、GSH-Px、CAT活性比较H2O2组心肌细胞中SOD、GSH-Px、CAT活性均显著低于空白对照组(P均<0.05)；黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组和黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组SOD、GSH-Px、CAT活性均显著高于H2O2组(P均<0.05)；黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组SOD、GSH-Px活性显著高于黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组(P均<0.05)，而2组间CAT活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　各组心肌细胞中SOD、GSH-Px、CAT

注：①与空白对照组比较，P<0.05；②与H2O2组比较，P<0.05；③与黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组比较，P<0.05。

2.3各组心肌细胞中ROS含量比较通过氧敏感荧光探针DCFH-DA检测及流式细胞仪进行分析发现，H2O2组ROS含量明显高于空白对照组；经黄芪多糖干预24 h后，H2O2诱导损伤乳鼠心肌细胞ROS含量明显低于H2O2组。见图1～10。

图1　DCFH-DA检测空白对照组心肌细胞ROS含量

图2　DCFH-DA检测H2O2组心肌细胞ROS含量

图3　DCFH-DA检测黄芪多糖20 μmol/L+H2O2组心肌细胞ROS含量

图4　DCFH-DA检测黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组心肌细胞ROS含量

图5　DCFH-DA检测黄芪多糖 80 μmol/L+H2O2组心肌细胞ROS含量

图6　空白对照组心肌细胞ROS含量(流式细胞仪)

图7　H2O2组心肌细胞ROS含量(流式细胞仪)

2.4各组心肌细胞培养液中AST、CPK、LDH和MDA含量比较H2O2组心肌细胞培养液中AST、CPK、LDH和MDA含量均显著高于空白对照组(P均<0.05)；黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组和黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组AST、CPK、LDH和MDA含量均明显低于H2O2组(P<0.05)；黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组CPK、MDA含量均显著低于黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组(P均<0.05)，而2组间AST、CPK、LDH含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

图8　黄芪多糖20 μmol/L+H2O2组心肌细胞ROS含量(流式细胞仪)

图9　黄芪多糖 40 μmol/L+H2O2组心肌细胞ROS含量(流式细胞仪)

图10　黄芪多糖 80 μmol/L+H2O2组心肌细胞ROS含量(流式细胞仪)表2　各组心肌细胞培养液中AST、CPK、LDH和MDA含量比较

组别nAST/(IU/mL)CPK/(IU/mL)LDH/(IU/L)MDA/(nmol/L)空白对照组1022.4±5.01.4±0.4518.5±73.80.21±0.04H2O2组1036.1±7.6①2.8±0.6①946.2±136.4①0.49±0.07①黄芪多糖20μmol/L+H2O2组1033.5±8.22.4±0.7871.6±142.80.42±0.09黄芪多糖40μmol/L+H2O2组1028.0±5.7②2.0±0.6②③748.3±115.0②0.31±0.06②③黄芪多糖80μmol/L+H2O2组1024.1±5.2②1.7±0.4②672.5±88.7②0.23±0.05②

注：①与空白对照组比较，P<0.05；②与H2O2组比较，P<0.05；③与黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组比较，P<0.05。

2.5各组心肌细胞凋亡情况空白对照组细胞凋亡率为(4.5±1.7)%，H2O2组为(57.9±8.2)%，黄芪多糖20 μmol/L+H2O2组为(48.6±7.4)%，黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组为(35.0±5.8)%，黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组为(17.1±5.2)%。H2O2组细胞凋亡率明显高于空白对照组(P<0.05)；黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组和黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组细胞凋亡率均显著低于H2O2组(P均<0.05)；黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组细胞凋亡率明显低于黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组(P<0.05)。各组心肌细胞凋亡情况见图11～15。

图11　空白对照组心肌细胞凋亡情况

图12　H2O2组心肌细胞凋亡情况

图13　黄芪多糖20 μmol/L+H2O2组心肌细胞凋亡情况

图14　黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组心肌细胞凋亡情况

图15　黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组心肌细胞凋亡情况

2.6各组心肌细胞中NF-κB蛋白表达情况空白对照组心肌细胞中NF-κB蛋白表达量为0.17±0.04，H2O2组为0.51±0.09，黄芪多糖20 μmol/L+H2O2组为0.42±0.10，黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组为0.36±0.07，黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组为0.24±0.06。H2O2组心肌细胞中NF-κB蛋白表达量明显高于空白对照组(P<0.05)，黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组和黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组心肌细胞中NF-κB蛋白表达量均显著低于H2O2组(P均<0.05)；黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组心肌细胞中NF-κB蛋白表达量显著低于黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组(P<0.05)。见图16。

A为空白对照组；B为H2O2组；C为黄芪多糖20 μmol/L+H2O2组；D为黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组；E为黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组图16　各组心肌细胞中NF-kB蛋白表达情况(Western blot)

3讨论

随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，冠心病及其所引发的急性心肌梗死发病率逐年上升，已经发展成为危害人类生命健康的主要疾病之一。目前临床上主要采取溶栓、介入支架等手段恢复血流供应，从而挽救患者生命，但再灌注损伤严重影响患者愈后。近年来研究表明缺血再灌注后随着氧的大量涌入，ROS大量生成和过剩而诱发的广泛氧化应激损伤是再灌注损伤关键病理基础[1]。

细胞中ROS过剩是机体发生氧化应激损伤的病理基础，所以ROS含量检测成为反映机体氧自由基损伤最直接的指标[7]。正常生理状态下，体内生成的ROS能够在SOD的催化作用下还原生成H2O2，并在GSH-Px或CAT催化作用下进一步还原生成对人无害的H2O和O2[8-9]，因此SOD、GSH-Px、CAT共同构成了机体的抗氧化防御系统，它们的活性直接反映机体抗氧化能力；此外，血清中脂质过氧化终产物MDA的含量也能够间接反映细胞损伤程度。正常生理状态下，血清中心肌酶含量非常低，而当细胞膜受氧自由基攻击而受损后将导致细胞中AST、CPK、LDH迅速释放入血，导致血清中AST、CPK、LDH活性陡然增高，因此血清中三者的活性水平能够敏感地反映心肌细胞受损程度。

氧化应激损伤是细胞凋亡非常重要的诱发因素之一，而NF-κB为多效能核转录因子，被称为连接氧化应激损伤和细胞凋亡的“桥梁”[10-11]。生理状态下，NF-κB以无活性形式存在于胞质中，而当细胞受到ROS攻击时，NF-κB将被活化并暴露出核定位信号而进入胞核内；Zhang 等[12]研究发现，活化NF-κB能够促进巨噬细胞活化和浸润，诱导促凋亡信号释放而导致细胞凋亡；Li 等[13]研究发现，被活化的NF-κB进入细胞核后能够与DNA的相应位点结合，参与调控下游相关靶基因的转录表达，包括诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，而iNOS可诱导NO生成继而引发细胞凋亡，证实NF-κB激活与氧化应激诱导的心肌细胞凋亡密切相关。

本实验结果发现，与H2O2组比较，黄芪多糖40 μmol/L+H2O2组和黄芪多糖80 μmol/L+H2O2组细胞存活率及细胞中SOD、GSH-Px、CAT活性显著升高，ROS含量显著降低，培养液中AST、CPK、LDH和MDA含量及细胞凋亡率、NF-κB蛋白表达量均显著降低。提示黄芪多糖可以能通过提高心肌细胞存活率、改善抗氧化酶活性、提高ROS清除能力、降低心肌酶含量、抑制细胞凋亡、下调NF-κB蛋白表达，从而对H2O2诱导乳鼠心肌细胞氧化应激损伤起保护作用，且高剂量效果更好。

[参考文献]

[1]Lamendola P,Di Monaco A,Barone L,et al. Mechanisms of myocardial cell protection from ischemia reperfusion injury and potential clinical implications[J]. Ital Cordial (Rome),2009,10(1):28-36

[2]Chen HL,Li DF,Chang BY,et al. Effects of Chinese herbal polysaccharides on the immunity and growth performance of young broilers[J]. Poult Sci,2003,82(3):364-370

[3]李红法,郭松波,满淑丽,等. 乙醇分级沉淀提取黄芪多糖及其理化性质和抗氧化活性研究[J]. 中国中药杂志,2015,40(11):2112-2116

[4]于胜男,曹琼丹,鲁美丽,等. 黄芪多糖对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响[J]. 中药药理与临床,2015,31(4):102-105

[5]巢蕾,周杰,朱萱萱,等. 黄芪多糖对人胃癌细胞系MKN45的生长抑制作用及细胞周期的影响[J]. 中华中医药学刊,2012,30(11):2474-2477

[6]李澎,王建农,卢树杰,等. 山楂叶原花青素对乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中国中药杂志,2009,34(1):96-99

[7]Misra MK,Sarwat M,Bhakuni P,et al. Oxidative stress and ischemic myocardial syndromes[J]. Med Sci Monit,2009,15(10):209-219

[8]Lartigue A,Burlat B,Coutard B,et al. The megavirus chilensis Cu,Zn-superoxide dismutase: the first viral structure of a typical CCS-independent hyperstable dimeric enzyme[J]. J Virol,2014,2588(14):254-261

[9]Jin Y,Liu K,Peng J,et al. Rhizoma dioscoreae nipponicae polysaccharides protect HUVECs from H2O2-induced injury by regulating PPARγ factor and the NADPH oxidase/ROS-NF-κB signal pathway[J]. Toxicol Lett,2014,232(1):149-158

[10] 陈良金,石孟琼,贺海波,等. 珠子参总皂苷对H2O2诱导新生大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用[J]. 中国临床药理学与治疗学,2012,17(8):860-867

[11] 杨帆,王永青,彭余江,等. NF-κB在颅脑损伤后继发氧化应激及细胞凋亡之间的关系研究[J]. 浙江创伤外科,2014,19(6):899-902

[12] Zhang Q,Huang WD,Lv XY,et al. Ghrelin protects H9c2 cells from hydrogen peroxide-induced apoptosis through NF-κB and mitochondria-mediated signaling[J]. Eur J Pharmacol,2011,654(2):142-149

[13] Li Q,Xu LS. Mechanism of destruction of islet cells by exogenous nitric oxide[J]. Med J Natl Def Force Northwest China,2002,23(5):361-363

Effects of Astraglus Polysaccharides on oxidative stress injury in neonatal rat cadiocytes induced by H2O2

SHEN Yujue

(Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effects of Astraglus Polysaccharides (APS) on oxidative stress injury of neonatal rat cadiocytes induced by H2O2. Methods Cadiocytes of neonate rat was separated and cultivated for 72 hours and then were divided into six groups: normal control group, H2O2 group, 20 μmol/L APS+H2O2 group, 40 μmol/L APS+H2O2 group, 80 μmol/L APS+H2O2 group, each group had 10 multiple pores. After intervention for twelve hours with respective drugs, the survival rate was detected by MTT; the activity of SOD, CAT, GSH-Px in cardiomyocytes were determined by ultraviolet-visible spectrophotometer; and the content of ROS was detected by fluorescence probe technique, the content of AST, CPK, LDH and the content of MDA in culture medium were detected by automatic biochemistry analyzer; the cardiomyocytes apoptosis was observed by flow cytometry and the apoptosis rate was calculated; the expression of NF-κB proten was detected by Western blot and Semi-quantitative analysized. Results Compared with H2O2 group, the survival rate in APS(40, 80 μmol/L)+ H2O2 groups were significantly increased; the activity of SOD, CAT in cardiomyocytes were significantly increased and the content of ROS were significantly decreased; the content of AST, CPK, LDH and MDA in culture medium were significantly decreased; the cardiomyocytes apoptosis were improved and the apoptosis rate were significantly decreased, the expression of NF-κB protein was significantly down-regulated, all of the difference were significant(P<0.05, P<0.01). Conclusion APS had inhibitive effects on oxidative stress of neonatal rat cadiocytes induced by H2O2, which perhaps related to its effects of improving the activity of antioxidase, enhancing the free radical scavenging ability, down-regulating the expression of NF-κB protein, depressing apoptosis.

Key words:Astraglus Polysaccharides; H2O2; cardiomyocytes; oxidative stress

[作者简介]沈玉珏，女，硕士，主治医师，主要从事心内科疾病研究工作。

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.010

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)19-2083-06

[收稿日期]2015-12-10