新藤黄酸诱导黑色素瘤B16细胞线粒体自噬的机制研究

陆　莹，李庆林

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230061)



新藤黄酸诱导黑色素瘤B16细胞线粒体自噬的机制研究

陆莹，李庆林

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230061)

[摘要]目的探讨新藤黄酸诱导黑色素瘤B16细胞线粒体自噬的机制。方法MTT试验检测新藤黄酸对黑色素瘤B16细胞增殖的抑制作用;倒置显微镜观察黑色素瘤B16细胞在新藤黄酸作用下产生的形态变化；透射电镜观察新藤黄酸对黑色素瘤B16细胞线粒体超微结构的影响；流式细胞术检测新藤黄酸诱导黑色素瘤B16细胞线粒体膜电位及ROS的改变；Western blot 法检测LC-3、mTOR、AMPK及SIRT3等自噬相关蛋白的变化。结果MTT结果显示新藤黄酸在体外对黑色素瘤B16细胞的生长及增殖有明显抑制作用，且随着新藤黄酸浓度的增加和作用时间的延长，细胞活力明显下降；倒置显微镜观察黑色素瘤B16细胞显示随着新藤黄酸浓度增加，细胞结构被明显破坏，细胞死亡增多；透射电镜观察发现新藤黄酸作用黑色素瘤B16细胞后，细胞发生明显的线粒体自噬的形态学变化；Western blot法检测表明随着新藤黄酸给药时间的延长， AMPK、SIRT3及LC3-Ⅱ蛋白表达量呈时间依赖性上升，LC3-I蛋白表达量呈时间依赖性下降，mTOR蛋白表达量随着时间延长有所下降。结论新藤黄酸在一定时间和浓度范围内能够抑制黑色素瘤B16细胞的增殖，诱导细胞发生线粒体自噬，其诱导细胞线粒体自噬的机制可能与调控ROS/SIRT3/AMPK信号通路有关。

[关键词]新藤黄酸;黑色素瘤；B16细胞；线粒体自噬;分子机制

皮肤黑色素瘤是一种源于黑色素细胞且恶性程度极高的肿瘤，属于皮肤癌的一种，因其具有易转移，对传统放、化疗均不敏感等特性及近年发病率呈逐年增高和相对年轻化趋势，使其成为现阶段国内外皮肤肿瘤研究的热点[1-2]，但目前尚未发现对黑色素瘤治疗效果良好的药物。藤黄是藤黄科植物藤黄树所分泌出来的干燥树脂，古医书中记载其具有解毒、抗炎和驱虫等生物学功能[3]，在现代中医临床中被广泛应用于治疗癌症、疮疡、毛囊炎等[4]。吕归宝等[5]于1984年分离得到一种分子结构与藤黄酸相类似的化合物，命名为新藤黄酸。本实验室前期的研究结果初步表明，新藤黄酸能够选择性抑制多种肿瘤细胞的生长，且与藤黄酸相比，其毒性较低，而抗肿瘤活性更加广泛。然而，目前人们对新藤黄酸的抗肿瘤作用机制还不十分清楚。本研究观察了新藤黄酸在体外抗黑色素瘤B16细胞的作用，并对其抗癌机制进行了初步探讨，现将结果报道如下。

1实验资料

1.1药物及实验试剂新藤黄酸(粉针，纯度≥99%，亮黄色结晶体)由安徽中医药大学王效山教授提供。新藤黄酸加入适量DMSO中，使其充分溶解，再用 RPMI-1640培养液将其稀释成100 mmol/L的母液，置于4 ℃冰箱中保存备用，保存时间不超过2周。RPMI-1640(Gibco公司)，胎牛血清(Thermo Fisher scientific公司)，胰蛋白酶(Amersco公司)，MTT(Amersco进口分装，武汉生命技术有限公司)，JC-1(Bestbio公司)，PBS(北京中杉生物技术有限公司)，BSA蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)，Western及IP细胞裂解液(江苏碧云天生物技术研究所)，PMSF(江苏碧云天生物技术研究所)。

1.2细胞株黑色素瘤B16细胞来源于本实验室。细胞在含10%胎牛血清的1640培养基中于37 ℃、5% CO2条件下培养，选取对数生长期细胞进行实验。

1.3主要仪器超净工作台(苏净集团安泰公司)，Spectra Max M5多功能酶标仪(美国MD公司)，Hi-tachi-600透射电子显微镜(日本日立)，FACS Calibur流式细胞仪(Flow Cytometry，美国Becton Dickinson公司)。

1.4方法

1.4.1MTT试验取对数生长期的黑色素瘤B16细胞消化收集，将细胞密度调整为6×104mL-1并接种于无菌的96孔板中，每孔加100 μL细胞悬液，实验设6个复孔，并设空白对照组。接种后培养过夜，在倒置显微镜下确认细胞贴壁良好，实验组加入不同浓度的新藤黄酸溶液(0，0.75，1.5，3.0，6.0 μmol/L)，细胞继续在培养箱中分别培养24，48，72 h。于结束培养前4 h小心吸去细胞培养液，每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃继续培养4 h，每孔再加入DMSO 150 μL，振荡10 min混匀。570 nm波长下用Spectra Max M5多功能酶标仪检测每孔光密度值(OD值)，实验重复3次，并按照下列公式计算：细胞增殖抑制率(%)=(阴性对照OD值-实验组OD值)/阴性对照OD值×100%。改良寇式法：lgIC50=Xm-I×[P-(3-Pm-Pn )/4][Xm为lg(最大剂量)；I为lg(最大剂量/相邻剂量)；P为阳性反应率之和；Pm为最大阳性反应率；Pn为最小阳性反应率]。

1.4.2倒置显微镜观察黑色素瘤B16细胞形态变化取对数生长期的黑色素瘤B16细胞消化收集，调整为4×104mL-1浓度的细胞悬液接种于无菌6孔板中，每孔加入2 mL。接种后培养过夜，确认贴壁良好后按实验分组加入不同浓度的新藤黄酸溶液(0，1.5，3.0 μmol/L)，处理24 h后置于倒置显微镜下观察各组细胞形态并拍照。

1.4.3透射电镜观察黑色素瘤B16细胞线粒体自噬情况取对数生长期的黑色素瘤B16细胞消化收集，接种于无菌6孔板，培养过夜后分别加入1.5，3.0 μmol/L新藤黄酸溶液处理24 h，空白对照组加完全培养基继续培养。胰酶消化后离心收集细胞，用预冷的PBS将细胞洗2遍，4 ℃环境下用2.5%戊二醛将细胞团块固定12 h以上，制备超薄切片，经枸橼酸铅染色，透射电镜下观察并摄片。

1.4.4流式细胞术检测黑色素瘤B16细胞线粒体膜电位消化收集分别用0，1.5，3.0，6.0 μmol/L新藤黄酸溶液处理24 h的黑色素瘤B16细胞，加入终浓度为5 μg/L的JC-1染液，于37 ℃、 5% CO2细胞培养箱中孵育10 min，800 r/min低速离心5 min，弃去上清液，用RMPI-1640培养基清洗细胞2次，将细胞重悬于培养基中，再于37 ℃、 5% CO2细胞培养箱中培养60 min，上流式细胞仪检测(激发波长488～505 nm，发射波长515～575 nm)。

1.4.5Western blot检测黑色素瘤B16细胞线粒体自噬相关蛋白变化将黑色素瘤B16细胞用3.0 μmol/L新藤黄酸溶液分别处理0,6,12,24 h后提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。10%～15%分离胶和5%浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜。以5%脱脂奶粉封闭，4 ℃一抗孵育过夜。PBST洗涤3次，每次10 min。再加HRP标记的二抗稀释液室温孵育2 h，PBST洗涤3次，每次10 min。ECL试剂盒显影，Bio-Rad凝胶成像系统采集图片。

2结果

2.1黑色素瘤B16细胞增殖抑制率黑色素瘤B16细胞增殖抑制率随新藤黄酸浓度的增加及作用时间的延长而升高(P<0.05)。见图1。

图1　不同浓度新藤黄酸作用不同时间黑色素瘤B16细胞增殖抑制率

2.2黑色素瘤B16细胞形态变化倒置显微镜观察发现，未加新藤黄酸处理的黑色素瘤B16细胞数目较多,细胞伸展良好,胞质均匀透明；1.5 μmol/L新藤黄酸作用黑色素瘤B16细胞24 h后，发现部分细胞固缩变圆，体积变小，少量细胞贴壁不牢，呈半贴壁状态；3.0 μmol/L新藤黄酸作用黑色素瘤B16细胞24 h后可观察到多数细胞固缩变圆，脱落，漂浮于培养液中，少数细胞体积增大、肿胀、破裂呈坏死状。见图2～4。

图2　未经新藤黄酸处理黑色素瘤B16细胞形态表现(×200)

图3　1.5 μmol/L新藤黄酸作用黑色素瘤B16细胞形态表现(×200)

图4　3.0 μmol/L新藤黄酸作用黑色素瘤B16细胞形态表现(×200)

2.3黑色素瘤B16细胞线粒体自噬情况透射电镜下可见未经新藤黄酸处理的黑色素瘤B16细胞形态未发生改变，细胞核染色质分布均匀，细胞线粒体形态正常，结构清晰,基本没有自噬线粒体形成；1.5 μmol/L新藤黄酸处理24 h后的黑色素瘤B16细胞内可见少量线粒体出现肿胀及空泡结构，未见脊断裂，细胞形态结构均接近于正常，只出现少量自噬线粒体；3 μmol/L新藤黄酸处理24 h后的黑色素瘤B16细胞可见核内出现染色质凝聚，出现大量自噬线粒体，线粒体结构紊乱且多空泡化，细胞内出现大量自噬空泡聚集，部分空泡内可见内容物，并有部分线粒体被包裹进囊泡。见图5～7。

2.4黑色素瘤B16细胞线粒体膜电位流式细胞仪检测结果显示，不同浓度的新藤黄酸溶液作用黑色素瘤B16细胞24 h后，线粒体膜电位水平随新藤黄酸浓度的增加而逐渐下降，其中6 μmol/L新藤黄酸作用24 h后，线粒体膜电位下降非常明显。见图8～11。

2.5黑色素瘤B16细胞内线粒体自噬相关蛋白表达情况3 μmol/L新藤黄酸作用黑色素瘤B16细胞后，随着作用时间的延长，AMPK、SIRT3 及LC3-II蛋白表达量呈时间依赖性上升，LC3-I蛋白表达量呈时间依赖性下降，mTOR蛋白表达量随着时间延长有所下降。见图12。

图5　未经新藤黄酸处理24 h后细胞线粒体自噬现象(×20 000)

图6　1.5 μmol/L新藤黄酸处理24 h后细胞线粒体自噬现象(×20 000)

图7　3.0 μmol/L新藤黄酸处理24 h后细胞线粒体自噬现象(×20 000)

图8　未经新藤黄酸处理24 h后黑色素瘤B16细胞线粒体膜电位

图9　1.5 μmol/L新藤黄酸处理24 h后黑色素瘤B16细胞线粒体膜电位

图10　3.0 μmol/L新藤黄酸处理24 h后黑色素瘤B16细胞线粒体膜电位

图11　6.0 μmol/L新藤黄酸处理24 h后黑色素瘤B16细胞线粒体膜电位

图12　黑色素瘤B16细胞内自噬相关蛋白表达情况

3讨论

据统计，目前恶性肿瘤已成为人类死亡原因的第一位，而黑色素瘤作为一种恶性皮肤瘤，因其易转移及对放化疗不敏感等特性，已成为当前研究热点之一。细胞线粒体自噬是发生在细胞内的一种选择性的自噬过程，最早由Lematsters于2005年提出，主要指在活性氧(ROS)、营养缺乏、细胞衰老等刺激下，细胞内的线粒体发生去极化损伤，而损伤的线粒体又被特异性地包裹进自噬体中，并与溶酶体融合，从而完成线粒体损伤的降解，维持细胞内环境的稳定。

SIRT3是NAD+依赖的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶的成员,这个家族简称sirtuins(SIRTS)，在整个SIRTS家族中,SIRT3作为线粒体去乙酰酶,对抗衰老和癌症发生的作用较明显,但是其作用机制还尚不明确,可能与线粒体内ROS水平相关，SIRT3可上调AMPK磷酸化水平，而 SIRT3H248Y对其磷酸化无影响，说明SIRT3激活AMPK磷酸化依赖于其去

乙酰化作用[6]。目前，AMPK在癌症中的作用已经受到众多研究者的广泛关注，其在正常组织中具有抑制肿瘤细胞形成的作用，而在体外，AMPK也被证明对多数人类肿瘤细胞株如肺癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌[7-9]具有毒性作用。同时研究发现在SIRT3缺失的小鼠生殖细胞系中，线粒体ROS的水平有所上调，而在SIRT3表达的细胞中ROS水平被抑制[10]。以上均表明SIRT3在线粒体中发挥作用，其缺失能够引起异常的线粒体代谢和细胞损伤，与恶性肿瘤的发生具有某种潜在联系。

本实验研究发现，新藤黄酸在体外对黑色素瘤B16细胞的生长及增殖有明显抑制作用，且随着新藤黄酸浓度的增加和作用时间的延长，细胞活力明显下降；随着新藤黄酸浓度增加，细胞结构被明显破坏，细胞死亡增多，细胞发生明显线粒体自噬的形态学变化；随着新藤黄酸给药时间的延长，AMPK、SIRT3及LC3-Ⅱ蛋白表达量呈时间依赖性上升，LC3-Ⅰ蛋白表达量呈时间依赖性下降，mTOR蛋白表达量随着时间延长有所下降。提示新藤黄酸能够在一定时间和浓度范围内抑制黑色素瘤B16细胞中ROS/SIRT3/AMPK这一信号传导通路的过度活化，诱导黑色素瘤B16细胞发生线粒体自噬。

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[3]南京医学院. 药材学[M]． 北京：人民卫生出版社，1960：1161

[4]周兰贞，晏烽根，李庆林． 新藤黄酸诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的作用机制研究[J]． 肿瘤，2011，31(7):580

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Study on the mechanism of mitochondrial autophagy in melanoma B16 cell induced by Gambogenic acid

LU Ying, LI Qinglin

(Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230061, Anhui, China)

Abstract:Objective It is to explore the mechanism of mitochondrial autophagy in melanoma B16 cell induced by Gambogenic acid. Methods MTT experiment was used to detect the inhibition of Gambogenic acid on proliferation of melanoma B16 cell. The morphology changes of the cells were observed under inverted microscope. The effect of Gambogenic acid on the mitochondrial ultrastructure was observed by transmission electron microscopy. Membrane potential and ROS changes in mitochondria were detected by flow cytometry.The correlated protein of mitochondrial autophagy such as LC-3, mTOR, AMPK and SIRT3 were detected by Western blot method. Results MTT results showed that Gambogenic acid has inhibition on the growth and proliferation of B16 cells, with the increase of concentration and time, the activity of the cells get lower and lower. The results under inverted microscope showed that with the concentration increase, the cell structure was damaged more obviously with more death cells. The results under transmission electron microscopy showed than the obvious morphology changes of B16 cells like mitochondrial autophagy could be found after induce by Gambogenic acid. Western blot method results showed that the expression of AMPK, SIRT3 and LC3-Ⅱ had a time dependence increase and LC3-Ⅰ had a time dependence decrease, that of mTOR decreased a little with time increase. Conclusion Gambogenic acid can inhibit the proliferation of B16 cell in some range of time and dosage, it can induce the mitochondrial autophagy, and the mechanism may be related with its regulation of ROS/SIRT3/AMPK signal pathway.

Key words:Gambogenic acid; melanoma B16 cell; mitochondrial autophagy; molecular mechanism

[作者简介]陆莹，女，在读硕士研究生，研究方向为分子药理学。

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.009

[中图分类号]R-33

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)19-2079-04

[收稿日期]2016-01-28