柳兰中总黄酮含量的测定

芦永昌，钱 帅，毛继祖，许生胜，马禅娟

（1. 青海民族大学药学院，青海 西宁 810007；2. 青海省青藏高原植物化学重点实验室）

柳兰中总黄酮含量的测定

芦永昌1，2，钱 帅1，2，毛继祖1，2，许生胜1，马禅娟1

（1. 青海民族大学药学院，青海 西宁 810007；2. 青海省青藏高原植物化学重点实验室）

利用正交实验对分离提取条件进行优化，研究柳兰中黄酮类化合物的分离提取和测定方法，以芦丁为标准品，采用AlCl3显色—分光光度法测得柳兰中总黄酮含量为1.60%，样品平均回收率99.15%，RSD为1.51%（n=5）。结果表明，最佳分离提取条件为：乙醇浓度为50%，固液比为1∶30（g•mL-1），提取温度为95℃，提取时间为4h。

柳兰;总黄酮;分光光度法; AlCl3显色法

柳兰为柳叶菜科柳兰属植物柳兰的全草，生长在海拔2700～4200m的山坡林缘及河谷湿草，分布于西北地区，味辛、苦，性平；有小毒;有利水渗湿，理气消胀，活血调经之功效。柳兰的藏药名为“贡布甲班区孜”，可治风寒湿热、疮疖疹毒、皮肤瘙痒。药理研究表明，柳兰有抗炎、抗氧化、抗焦虑及抑制前列腺细胞增殖的作用。柳兰全草含槲皮素，金丝桃苷等黄酮或多酚类化合物，但至今还未见对柳兰中总黄酮含量测定的相关研究报道。本研究以芦丁为对照品，通过AlCl3显色法对柳兰中总黄酮的含量进行测定，以期为其生物活性评价及药理作用研究提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

芦丁对照品（批号：20040412，上海润捷化学试剂有限公司）；石油醚（沸程：60～90℃）；无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、氯化铝均为分析纯。

柳兰于2015年7月采自青海省互助县北山林场，经青海民族大学药学院毛继祖教授鉴定，阴干粉碎，过80目筛保存待用。

1.2 仪器

FW7362M/24电子分析天平（德国制造）；SHB-111循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

2 试验方法

2.1 柳兰样品的预处理

取待用柳兰样品用滤纸包好，放入索氏提取器中用石油醚加热提取6h后置于通风处晾干。

2.2 芦丁标准溶液的配制

芦丁标准溶液：准确称取适量芦丁标准对照品，加适量无水乙醇溶解，稍加热溶解，冷却后移入容量瓶，用乙醇定容。

2.3 柳兰中总黄酮的提取

精密称取2.00g经石油醚抽提后的柳兰样品，置于圆底烧瓶中，按固液比为1∶30（g•mL-1）加入50%的乙醇溶液，在95℃的温度下加热回流提取4h，将提取液过滤后定容于100mL。

2.4 标准曲线的绘制

准确移取0mL、0.40mL、0.80mL、1.20mL、1.60mL、2.00mL、2.20mL芦丁标准溶液于7个25mL容量瓶中，各加入1%的AlCl3溶液3.00mL，用10%的乙醇定容，显色20min后在417nm处测定吸光度，同时以未加标准芦丁的溶液作空白参比。以吸光度A为纵坐标，芦丁浓度c为横坐标作图，回归方程为：A=28.766c+0.0062，R=0.9998。

2.5 样品中总黄酮含量的测定

取适量样液于25mL容量瓶中，按照测定芦丁标准液吸光度的步骤，同时做试剂空白，以试剂空白为对照，于417nm处测定吸光度A；计算柳兰中总黄酮的含量（%），重复5次，取平均值。按下列公式计算：柳兰中总黄酮含量=c×V1×V2/ (V3×W×1000)×100%，式中：c为由回归方程计算得到的待测液的浓度，V1为提取液体积（mL）；V2为稀释后提取液体积（mL）；V3为移取样液的体积（mL）；W为柳兰的重量。

3 结果与分析

3.1 显色方法的选择

采用两种显色方法：在碱性条件下的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法和在酸性条件下的AlCl3显色法分别实验。两种方法显色机理不同，前者显色后溶液为橙红色，而酸性条件下AlCl3显色法为黄色溶液。在300～600nm检测最大波长，见图1和图2。

图1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色法吸收曲线

图2 酸性条件下AlCl3显色法的吸收曲线

由图1-2可见，芦丁标准品经AlCl3显色后在417nm处有较明显的吸收峰，而NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法中芦丁与Al3+配合物在可见光波长范围内（390～780nm）的峰值在510nm左右，但该处的吸收峰相对于AlCl3显色法较弱。考虑到柳兰的黄酮提取液样品中可能含有较多的杂质，且在碱性条件下，有些非黄酮类物质会在510nm附近有最大或较强吸收，因而选用AlCl3显色法测定柳兰中黄酮类化合物具有更好的专属性。

3.2 溶剂的选择及样品预处理

黄酮类物质水溶性较差，醇溶性较好，常用甲醇和乙醇作提取溶剂，但考虑到甲醇的毒性，而且乙醇不仅可以去除一部分亲水性蛋白质、果胶及其他水溶性杂质，而且毒性小，价格低廉，可以回收利用，因此采用乙醇作为提取溶剂。但直接将柳兰用乙醇提取，会不可避免地将脂溶性色素一起提取出来，为了消除叶绿素等物质的影响，本试验采用60～90℃沸程石油醚索氏提取6h的方法进行简单的提纯，排除部分干扰物质。样品经石油醚脱脂、脱色脱蜡处理可提高总黄酮的提取率。这可能是由于蜡质的破坏及脂类的消除，有利于极性提取剂的渗透和黄酮类物质的渗出。

3.3 正交试验

在单因素试验的基础上，选取影响柳兰总黄酮提取效果各因素中有意义的水平做正交试验，选择乙醇的浓度（A）、料液比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）4 个因素，采用四因素三水平 L9（34）正交试验表安排试验，确定最佳提取工艺，因素及水平见表1，试验分析结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 正交试验中的因素及水平

表2 正交试验结果分析

表3 方差分析

由表2分析结果可知，因素C和D的第3水平较好，因素A的第1水平较好， 因素B的3个水平差别不大。于是选出来的最优提取条件是A1B1C3D3，即柳兰中总黄酮的最佳提取分离条件是：乙醇浓度为50%，固液比为1∶30（g•mL-1），提取温度为95℃，提取时间4h。由表3可知，因素C、D高度显著，因素A、B不显著。影响柳兰中总黄酮提取的个因素主次顺序为：提取时间>提取温度>乙醇浓度>料液比。

3.4 柳兰中总黄酮含量的测定

在最佳提取条件下，用AlCl3显色法测得柳兰中总黄酮含量为1.60%（RSD%=0.61，n=5）。

4 方法学考察

由于AlCl3显色法测定结果较NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定结果准确，对AlCl3显色法在线性关系良好的基础上进一步进行方法学考察。

4.1 稳定性实验

按照绘制标准曲线时采用的显色方法在417nm处测定吸光度的稳定性，每隔5min测一次，结果表明，该方法在30min内稳定性良好。

4.2 精密度实验

精密量取定容后的提取液，加入配好的AlCl3溶液，再用10%乙醇定容至25mL，待20min后在417nm下测定吸光度，测得RSD%为0.14%（n=5）。

4.3 回收率实验

称取已知含量经石油醚抽提后的柳兰干品5份，每份0.75g，分别加入适量的芦丁对照品，按照前述操作进行处理，测定吸光度，计算平均回收率99.15%，RSD%为1.51（n=5）。结果表明，该方法准确度良好。

5 小结

实验结果表明：柳兰中黄酮类化合物的最佳分离提取条件为：乙醇浓度为 50%，固液比为1∶30（g•mL-1），提取温度为95℃，提取时间为4h。用 AlCl3显色法测得柳兰中总黄酮的含量为1.60%，样品平均回收率为99.15%，RSD 值为1.51%。

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Assay Study on Total Flavanoids in Chamaenerion angustifolium

LU Yongchang1,2, QIAN Shuai1,2, MAO Jizu1,2, XU Shengsheng1, MA Chanjuan1
(1. College of Pharmacy, Qinghai Nationalities University, Xining 810007, China; 2. Key Laboratory of Plant Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Chemical Research)

This paperi, the extraction and separation of the total flavones from Cham aenerion angustifolium were studied. The extraction process conditions were optimized by using orthogonal test. Under the above conditions,the content of total flavones from dry Cham aenerion angustifolium was 1.60%. The average recovery rate and RSD were 99.15% and 1.51% respectively（n = 5）. Results showed that the optimal extraction conditions were as ethanol concentration 50%，ratio of raw material to ethanol solution 1∶30（g•mL-1），extraction temperature 95 ℃ and extraction time 4 h.

cham aenerion angustifolium; total flavonoids; UV-Vis spectrophotometry; AlCl3coloration

R284

A

1003-4749（2016）11-0013-04

2016-07-15

青海省重点实验室发展专项（2014-Z-Y13），青海民族大学校级理工自然科学项目（2015XJZ05）

芦永昌(1965-)，男，陕西蓝田人，教授，主要从事中藏药质量控制工作。