西北部分地区猪蛔虫rDNA ITS基因序列测定及遗传变异分析

邹　勇，吴　飞，郭雅旭，耿晓蕊，张文慧，王玉霞，李希来，林　青,*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100; 2.青海大学农牧学院，青海西宁 810016)



西北部分地区猪蛔虫rDNA ITS基因序列测定及遗传变异分析

邹勇1，吴飞1，郭雅旭1，耿晓蕊1，张文慧1，王玉霞1，李希来2，林青1,2*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100; 2.青海大学农牧学院，青海西宁 810016)

摘要：为了摸清西北部分地区猪蛔虫内转录间隔区(ITS)的遗传变异特点，扩增了猪蛔虫ITS基因，进行测序，依据GenBank公布的ITS序列将测序结果截为ITS1、5.8S及ITS2三段，分析比对各段序列的差异性。结果显示，所有样品ITS序列长约1 000 bp，其中ITS1、5.8S和ITS2的长度分别为450 bp～453 bp、159 bp、272 bp，种内差异分别为0～0.2%、0、0。基于ITS1的种系发育分析表明，23个猪蛔虫样品均位于同一分支，而与贝蛔属蛔虫分属两个不同分支。ITS1序列不能作为区分西北不同地区猪蛔虫的种内分子标记，但可以作为区分蛔属蛔虫与贝蛔属蛔虫的种间分子标记，研究结果为猪蛔虫的鉴定和分子流行病学调查提供了基础资料。

关键词：猪蛔虫； 核糖体DNA；转录间隔区；序列测定；遗传变异

猪蛔虫病(Ascariasis)是由猪蛔虫(Ascarissuum)寄生于猪小肠引起的一种线虫病，该病呈全球性分布，我国猪蛔虫感染率为17%～80%[1]。患猪生长受阻、饲料回报率低、肉品质下降，给养猪业造成重大经济损失[2]。猪蛔虫的幼虫在“移行”的过程中可导致猪肝脏、肺脏、呼吸道等器官出现炎症反应，严重时肝表面出现“乳斑”、肺脏出现水肿[2-4]。此外，猪蛔虫还能感染猩猩、长臂猿等灵长类动物以及人[5-6]。因此，准确鉴定猪蛔虫分离株具有重要的公共卫生学及畜牧学意义。传统的猪蛔虫分类鉴定常基于形态学特点[7]，难以区分由于宿主及地理等环境等因素引起的变异虫株。随着分子生物学技术的发展，分子鉴定已成为寄生虫虫种、亚种及遗传变异最直接的鉴定方法[8]。核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)位于18S和28S基因之间，包含ITS1、5.8S和ITS2共3个基因片段[9]，由于该段序列具有复制倍数多、选择压力低、进化速度快及长度序列变异大且在种内及种间均存在变异的特点[10-11]，因此该段序列作为遗传分子标记已广泛的应用于多种寄生虫的分类鉴定[12-13]。目前，猪蛔虫的种群遗传结构的研究主要集中于猪蛔虫与人蛔虫的分类鉴别方面[14-16]，而国内关于不同地域猪蛔虫群体的种内变异未见报道。

本研究以西北不同地区(陕西周至、甘肃武威、宁夏青铜峡和青海西宁)猪蛔虫分离株为试验对象，利用聚合酶链反应(PCR)扩增其rDNA ITS基因，通过分析该基因的遗传变异情况并构建系统发育树，评估该基因序列作为种内分子标记的可能性，为猪蛔虫的鉴定和分子流行病学调查提供基础资料。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1虫体样品猪蛔虫样品共23条，分别采自于陕西周至、甘肃武威、青海西宁及宁夏青铜峡某生猪屠宰场(表1)。经形态学初步鉴定为猪蛔虫，用清水洗净虫体表面的粪便后，置于750 mL/L的乙醇中固定，置-20℃保存并做好标记。

1.1.2试剂2×TaqMaster Mix试剂为康为世纪生物科技有限公司产品；基因组DNA提取试剂盒为天根生物科技有限公司产品；琼脂为Amresco公司产品； DNA Marker DL 2 000、溴化乙锭和6×Loading buffer为宝生物工程(大连)有限公司产品；柱式DNA胶回收试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；大肠埃希菌DH5α感受态细胞、PMEG-T Easy载体试剂盒为Promega公司产品；无水乙醇为天津福晨化学试剂厂产品。

1.2方法

1.2.1虫体基因组DNA的提取将单个虫体从750 mL/L的乙醇保存溶液中取出，置于无菌的平皿中，用灭菌蒸馏水反复冲洗2次～3次，截取一小段约1 cm的虫体置于经高压灭菌处理过的1.5 mL的离心管中，用灭菌的眼科剪将虫体剪碎，加入200 μL GA buffer，用研磨棒反复研磨至匀浆状，再加入20 μL蛋白酶K，充分混匀，水浴56℃过夜消化，将消化完全的组织液按基因组DNA提取试剂盒说明书提取猪蛔虫DNA，提取的DNA置于-20℃冰箱中，保存备用。

表1　猪蛔虫成虫样品分离株信息

1.2.2PCR扩增及反应条件采用通用引物NC5/NC2[17]扩增猪蛔虫分离株的ITS基因，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，上游引物NC5：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCAT- T-3′，下游引物NC2：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′。采用25 μL反应体系进行PCR扩增，其中2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增条件为： 95℃ 5 min；94℃ 40 s， 50℃ 40 s， 72℃ 1 min，35个循环;72℃ 10 min，4℃结束反应。取3 μL PCR产物与1 μL 6×Loading buffer混合均匀后，小心加样于10 g/L TBE琼脂糖凝胶点样孔中，以相同体积的DNA Marker DL 2 000作为对照进行电泳，设定电泳条件为100 V、电泳时间30 min，凝胶成像系统观察结果。

1.2.3ITS基因序列的克隆及测序将阳性PCR产物进行凝胶电泳，在紫外透射仪中切割含有目的条带的胶块，置于经高温灭菌处理过的1.5 mL离心管中，按柱式DNA胶回收试剂盒说明书操作，对扩增片段进行纯化，置-20℃保存备用。将回收产物连接到PMEG-T Easy载体上，然后将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，在含氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB平板上37℃培养过夜，无菌挑选白色的单菌落接种于含有1 000 μL和1.5 μL的氨苄青霉素的LB培养液中，并做好标记，置于摇床上37℃、200 r/min摇床10 h。按照ITS扩增体系对菌液进行PCR扩增，经凝胶电泳检测，选取与DNA的PCR产物条带大小一致的菌液，送上海生工生物技术服务有限公司进行双向测序。

1.2.4序列分析及种系进化树的构建将测序结果拼接后在NCBI中进行Blast比对，依据NCBI上公布的ITS基因序列(登录号：AB571302)，将所测ITS序列结果截为ITS1、5.8S和ITS2。用Clustal 1.83软件分别对不同基因序列进行比对，利用DNAstar 5.0 软件中的Megalign程序进行同源性比对并计算种间及种内差异。从GenBank数据库中检索现有蛔目ITS1基因序列，以鸡蛔虫为外群(Ascaridiagalli，登录号：AM408550)，以人蛔虫(Ascarislumbricoides，登录号：AB571295)、浣熊贝蛔虫(Baylisascarisprocyonis，登录号：JQ403615)、西氏贝蛔虫(Baylisascarisschroederi，登录号：JN210911)、狮弓蛔虫(Toxascarisleonina，登录号：JF837178)及横走贝蛔虫(Baylisascaristransfuga，登录号：AB571304)为参考虫株构建系统发育树。用MEGA4.0程序中的邻接法(NJ)、最大似然法(ML)，选用Kimura2-parameter模式绘制系统发育树，采用自展检验估算所构建系统树的可靠性，复制数均为1 000。

2结果

2.1猪蛔虫r DNA ITS基因扩增

对采自陕西周至、宁夏青铜峡、青海西宁和甘肃武威四个地区的23条猪蛔虫样品的ITS基因片段进行PCR扩增，成功扩增出长约1 000 bp的片段，与预期目的片段长度相符，且无非特异性条带(图1)。

2.2ITS基因序列比对及遗传变异分析

23个猪蛔虫分离株样品的ITS基因的序列长度相同，剔除两端的引物序列后，得到881 bp～884 bp的序列，其中ITS1长度为450 bp～453 bp，5.8S长度为159 bp，ITS2长度为272 bp。对所有猪蛔虫样品的ITS1、5.8S和ITS2序列经Clustal 1.83软件比对分析。发现5.8S和ITS2的核苷酸无碱基的颠换和置换，相似性为100%，这与朱兴全等的研究结果相一致[17]。对所有猪蛔虫样品的ITS1序列进行两两比较(图2)，ITS1的种内变异为0～0.2%，相似性为98.7%～100%。来自甘肃武威、青海西宁、宁夏青铜峡地区猪蛔虫ITS1序列的种内差异均为0～0.2%，而陕西周至地区的6个猪蛔虫样品则未检测到种内变异。本试验样品与人蛔虫(AB571295)的属内种间差异为0.4%～0.7%，与浣熊贝蛔虫(登录号：JQ403615)的种间差异为10.6%～10.9%，与西氏贝蛔虫(登录号：JN210911)的种间差异为12.9%～13.3%，与横走贝蛔虫(登录号：AB571304)的种间差异为11.2%～11.5%。

M.DNA标准DL 2 000；1～6.青海分离株QH1、QH2、QH3、QH4、QH5、QH6；7～11.宁夏分离株NX1、NX2、NX3、NX4、NX5；

2.3系统发育树的构建及分析

为了研究西北不同地区猪蛔虫的遗传进化关系，基于ITS1 rDNA基因采用Mega 4.0软件中的邻接法(Neighbour-joining，NJ)、最大似然法(Maximum likelihood，ML)构建蛔目系统发育树(图3),节点处数据由左至右依次为NJ/ML的Bootstrap值(%)。所有不同地区的猪蛔虫分离株与猪蛔虫参考株(登录号：AB571302)位于同一分支并与人蛔虫(登录号：AB571295)合为姐妹支。浣熊贝蛔虫(登录号：JQ403615)、西氏贝蛔虫(登录号：JN210911)及横走贝蛔虫(登录号：AB571304)聚类在另一分支，与猪蛔虫和人蛔虫所处分支合为一大支，随后再与狮弓首蛔虫(登录号：JF837178)所在分支聚拢。所有猪蛔虫分离株聚类在同一分支，但不能将不同地区分离株分开。

图3西北部分地区猪蛔虫分离株种群遗传进化树(NJ/ML)法

Fig.3Phylogenetic tree ofA.suumisolated from different regions in northwest China，using NJ and ML methods

3讨论

遗传变异普遍存在于各种生物中，基于分子生物学的鉴别方法已成功用于寄生虫的分类鉴定[18-19]。本研究发现，试验样品的5.8S和ITS2基因序列无种内变异，ITS1的种内变异为0～0.2%，相似性为98.7%～100%。来自甘肃武威、青海西宁、宁夏青铜峡地区猪蛔虫ITS1序列的种内差异均为0～0.2%，而陕西周至地区的6个猪蛔虫样品则未检测到种内变异。说明西北不同地区猪蛔虫ITS基因中的5.8S和ITS2序列十分保守，而ITS1序列存在种内变异，但变异率较低。而与人蛔虫(AB571295)的属内种间差异为0.4%～0.7%，与浣熊贝蛔虫(登录号：JQ403615)的种间差异为10.6%～10.9%，与西氏贝蛔虫(登录号：JN210911)的种间差异为12.9%～13.3%，与横走贝蛔虫(登录号：AB571304)的种间差异为11.2%～11.5%，说明ITS1基因的种内变异小而种间变异大。基于ITS1基因构建的系统发育树分析，发现不同地区的猪蛔虫与猪蛔虫参考株(登录号：AB571302)位于同一分支并与人蛔虫(登录号：AB571295)合为姐妹支。并与浣熊贝蛔虫(登录号：JQ403615)、西氏贝蛔虫(登录号：JN210911)及横走贝蛔虫(登录号：AB571304)聚类在另一分支，与猪蛔虫和人蛔虫所处分支合为一大支，随后再与狮弓首蛔虫(登录号：JF837178)所在分支聚拢。说明分离的蛔虫样品均确定为猪蛔虫，且与人蛔虫关系最近。所有猪蛔虫分离株聚类在同一分支，但不能将不同地区分离株分开。说明ITS1基因不能揭示不同地区猪蛔虫的种内遗传差异，该基因不能作为鉴别不同地区猪蛔虫的分子标记。所有猪蛔虫分离株与贝属蛔虫位于两个不同分支上，说明猪蛔虫与贝属蛔虫的亲缘关系较远，即ITS1基因可以作为鉴定猪蛔虫与贝属蛔虫的种间分子标记。研究结果为中国西北地区猪蛔虫的鉴定及分子流行病学调查提供了基础资料。

参考文献：

[1]汪明.兽医寄生虫学[M].3版.北京：中国农业出版社，2003.

[2]Sanchez-Vazquez M J,Nielen M,Gunn G J,et al.National monitoring ofAscarissuumrelated liver pathologies in English abattoirs:a time-series analysis,2005-2010 [J].Vet Parasitol,2012,184(1):83-87.

[3]Vlaminck J,Düsseldorf S,Heres L,et al.Serological examination of fattening pigs reveals associations betweenAscarissuum,lung pathogens and technical performance parameters [J].Vet Parasitol,2015,210(3-4):151-158.

[4]Cho E S,Park B K,Son H Y.Effects ofAscarissuumextract and sulfamethoxazole on allergic airway inflammation [J].Biomol Ther,2011,19(4):466-471.

[5]Nejsum P,Bertelsen M F,Betson M,et al.Molecular evidence for sustained transmission of zoonoticAscarissuumamong zoo chimpanzees (Pantroglodytes) [J].Vet Parasitol,2010,171(3-4):273-276.

[6]Arizono N,Yoshimura Y,Tohzaka N,et al.Ascariasis in Japan:is pig-derivedAscarisinfecting humans [J].Jpn J Infect Dis,2010,63(6):447-448.

[7]Ansel M,Thibaut M.Value of the specific distinction betweenAscarislumbricoidesLinnè 1758 andAscarissuumGoeze 1782 [J].Int J Parasitol,1973,3(3):317-319.

[8]Huang S Y,Zhao G H,Fu B Q,et al.Genomics and molecular genetics ofClonorchissinensis:current status and perspectives [J].Parasitol Int,2012,61(1):71-76.

[9]Powers T O,Todd T C,Burnell A M,et al.The rDNA internal transcribed spacer region as a taxonomic marker for nematodes [J].J Nematol,1997,29(4):441-450.

[10]Pecson B M,Barrios J A,Johnson D R,et al.A real-time PCR method for quantifying viableAscariseggs using the first internally transcribed spacer region of ribosomal DNA [J].Appl Environ Microbiol,2006,72(12):7864-7872.

[12]Liu J,Guan G,Liu Z,et al.Additional data for a newTheileriasp.from China based on the sequences of ribosomal RNA internal transcribed spacers [J].Exp Parasitol,2013,133(2):217-221.

[13]Salaba O,Rylková K,Vadlejch J,et al.The first determination ofTrichurissp.from roe deer by amplification and sequenation of the ITS1-5.8S-ITS2 segment of ribosomal DNA [J].Parasitol Res,2013,112(3):955-960.

[14]Peng W,Criscione C D.Ascariasis in people and pigs:new inferences from DNA analysis of worm populations [J].Infect Genet Evol,2012,12(2):227-235.

[15]Zhou C,Li M,Yuan K,et al.PigAscaris:an important source of human ascariasis in China [J].Infect Genet Evol,2012,12(6):1172-1177.

[16]Cavallero S,Snabel V,Pacella F,et al.Phylogeographical studies ofAscarisspp.based on ribosomal and mitochondrial DNA sequences [J].PLoS Negl Trop Dis,2013,7(4):e2170.

[17]Zhu X Q,Chilton N B,Jacobs D E,et al.Characterisation ofAscarisfrom human and pig hosts by nuclear ribosomal DNA sequences [J].Int J Parasitol,1999,29(3):469-478.

[18]Mandal M,Banerjee P S,Garg R,et al.Genetic characterization and phylogenetic relationships based on 18S rRNA and ITS1 region of small form of canineBabesiaspp.from India [J].Infect Genet Evol,2014,27:325-331.

[19]Homan W L,Limper L,Verlaan M,et al.Comparison of the internal transcribed spacer,ITS1,fromToxoplasmagondiiisolates andNeosporacaninum[J].Parasitol Res,1997,83(3):285-289.

Sequencing and Phylogenetic Analysis on rDNA ITS Genes ofAscarissuumisolates from Different Regions in Northwest China

ZOU Yong1,WU Fei1,GUO Ya-xu1,GENG Xiao-rui1,ZHANG Wen-hui1,WANG Yu-xia1,LI Xi-lai2,LIN Qing1,2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity,Yangling，Shaanxi,712100,China;2.CollegeofAgricultureandAnimalHusbandry,QinghaiUniversity,Xining,Qinghai,810016,China)

Abstract:To illuminate the genetic variation characteristics ofAscarissuumisolated from different regions in northwest China,the internal transcription spacer (ITS) genes were amplified by using the PCR method with the conserved primers NC5/NC2.After the amplicons were cloned and sequenced,the sequencing results were divided into ITS1,5.8S and ITS2 according to the public sequence in GenBank.And then those genes were compared and aligned to build phylogenetic tree.The results showed that the ITS genes of allA.suumsamples were amplified successfully with the length of 1 000 bp approximately,including 450 bp-453 bp for ITS1,159 bp for 5.8S and 272 bp for ITS2 and the intra-specific differences were 0-0.2% for ITS1,0 for 5.8S,0 for ITS2.Phylogenetic analysis displayed that allA.suumsamples were monophyletic groups and located in different clusters with the reference sequences of the genusBaylisascaris.Therefore,the ITS genes were not suitable to serve as molecular marker to distinguish theA.suumisolates from different regions in northwest China,but it can be used as intraspecific genetic marker to identify the generaAscarisandBaylisascaris.Those findings may provide basic data for the identification and molecular epidemiology investigation ofA.suum.

Key words:Ascarissum; rDNA ITS gene; sequencing; genetic diversity

收稿日期：2015-11-17

基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT13074);科技部国际合作项目(2015DFG31870)

作者简介：邹勇(1988-)，男，湖南邵阳人，硕士研究生，主要从事动物疫病防治研究。*通讯作者

中图分类号:S852.7

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)06-0035-05