中性条件下2种酶解方法提取蚕蛹蛋白的比较研究

张丽丽，章玉萍，陈明，代君君，吴传华，范涛（安徽省农业科学院蚕桑研究所，合肥230061）



中性条件下2种酶解方法提取蚕蛹蛋白的比较研究

张丽丽，章玉萍，陈明，代君君，吴传华，范涛
（安徽省农业科学院蚕桑研究所，合肥230061）

摘要：为了寻求经济实用的酶解蚕蛹蛋白的方法，本研究以新鲜和烘干蚕蛹为原料，在中性条件下比较了中性蛋白酶和风味蛋白酶对蚕蛹的水解程度及蛋白收率。结果表明：在中性条件下2种蛋白酶作用后鲜蛹水解蛋白液的蛋白收率和水解度高于干蛹水解蛋白液。风味蛋白酶水解后的蛋白收率高于中性蛋白酶，但水解度小于中性蛋白酶，造成这样的原因可能是由于风味蛋白酶的内切酶活性较低。因此，在实际应用中可尽量采用新鲜蚕蛹为原料，并根据蛋白水解产物不同的需求采用不同的蛋白酶进行处理。

关键词：蚕蛹蛋白；酶解；蛋白收率；水解度

0　引言

蚕蛹是一种经济价值和开发价值均较高的自然资源，是一种全价蛋白质，含有18种氨基酸组分，比例均衡，含量高达60%，是一种较为理想的优质蛋白［1-2］。

中国是世界上最大的茧丝生产国和供应国，2014年全国桑蚕发种量1626万张，蚕茧总产量64万t［3］。然而长期以来，中国的蚕蛹加工利用率极低，除少数经烘干粉碎作为营养添加剂外，多数用作饲料甚至肥料，还有很多被废弃，资源的再生和利用效率低［4-5］。随着蚕丝业的不断发展，蚕蛹的产量将会更大，开发利用蚕蛹资源具有重要的意义和广阔的前景。

但蚕蛹本身的某些性质限制了它在食品加工中的应用［6］。利用蛋白酶水解蚕蛹蛋白，可改善它的功能性质，使其溶解性和热稳定性均增加，凝胶性降低，有利于进一步加工，拓宽蚕蛹蛋白的应用范围。而且蛋白质水解后分子量变小，比蛋白质更易消化吸收，提高了生物利用率［7-8］。现代研究表明，蚕蛹蛋白不仅具有较高的营养价值，其水解产物还具有某些生物活性。超滤分离酶解缫丝蚕蛹蛋白后，得到的分子质量为200～300 D的蛋白肽的抗氧化能力比酶解原液有一定提高［9］。酶解后的蚕蛹蛋白还可制备血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽，通过抑制ACE活性起降血压作用［10］。

目前蛋白水解的方法有酸水解法、碱水解法和酶水解法。酸水解法中多采用盐酸，反应强烈并完全，但盐酸会使设备腐蚀严重，并且高温下色氨酸被完全破坏。碱水解法在水解过程中使氨基酸大都消旋，无生物利用价值［11］。而酶水解法条件温和，安全可靠［12］。经过水解分离精制得到的多肽，具有高溶解性、高稳定性、高吸湿保湿性、抗凝胶性等特点［13］。尤其中性条件下酶水解，不仅可以减少后期的中和及除盐步骤，简化了工艺流程和加工设备，更可以节省时间提高效率。本研究中采用的中性蛋白酶和风味蛋白酶是当前酶解工艺中较为常用的酶，在中性或近似中性条件下作用效率高。目前对蚕蛹蛋白的酶解研究大多采用烘干蚕蛹为原料，笔者对中性条件下2种蛋白酶对鲜蛹和干蛹的水解进行了比较，旨在为进一步利用蚕蛹蛋白提供了基础数据。

1　材料与方法

1.1试验材料

2015年春季饲养‘菁松×皓月’，上蔟后第7天用刀片将蚕茧削开取出蚕蛹。一部分鲜蛹置于-30℃冰箱内冷冻，另一部分蚕蛹置于烘箱中80℃烘至恒重。

取一定量鲜蛹80℃烘干至恒重后，用超微粉碎机粉碎成粉末过筛备用。试验在安徽省农业科学院蚕桑研究所实验室，于2015年6—8月进行。

1.2主要试剂和仪器

中性蛋白酶、风味蛋白酶（北京索莱宝生物科技有限公司），氢氧化钠、硼酸、盐酸、甲醛溶液等均为分析纯。

FA1204N型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司生产；K9840凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司生产；电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司生产；QYC-2012C全温培养摇床，上海新苗医疗器械制造有限公司；5430R高速离心机，Eppendorf生产；pH计，奥豪斯仪器上海有限公司生产；SQ211B多功能食品加工机，上海帅佳电子科技有限公司生产。

1.3试验方法

1.3.1总氮含量的测定改良凯氏定氮法［14］。

1.3.2氨基态氮的测定［15］吸取酶水解液5 mL于烧杯中，加入20 mL水，用0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH 8.2，记录数据，再加入已中和好的甲醛溶液10 mL，记录滴定至pH 9.2时所消耗0.1 mol/L的NaOH的体积数。根据公式（1）计算得出氨基态氮的含量（mg/mL）。

式中：V1为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数，V2为滴定空白样品耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数，NNaOH为标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度。

1.3.3水解率的测定计算见公式（2）。

1.3.4蛋白质收率计算见公式（3）。

1.3.5酶解方法和酶解工艺基本的水解流程为蛹粉或蛹浆→加蒸馏水→酶解→终止反应→离心→水解蛋白液。

称取5 g蚕蛹粉，加入45 g蒸馏水，分别加入中性蛋白酶或风味蛋白酶0.05 g，反应温度分别为40℃和50℃，置气浴振荡器中140 r/min振荡3 h。反应结束时，将反应液置于沸水浴中5 min灭酶终止反应。离心吸出上层油脂层并弃沉淀即得水解蛋白液。

500 g鲜蛹烘干后可得干蛹162.5 g。折合5 g干蛹质量，称取15 g鲜蛹用自来水冲洗，沥干水份后加45 g水匀浆，滤去蛹皮等不溶物。分别加入中性蛋白酶或风味蛋白酶0.05 g，反应温度分别为40℃和50℃，置于气浴振荡器中140 r/min振荡3 h。反应结束时，将反应液置于沸水浴5 min灭酶终止反应。离心吸出上层油脂并弃沉淀即得水解蛋白液。

2　结果与分析

2.1蛋白酶对蚕蛹蛋白收率的影响

由图1可知，中性蛋白酶和风味蛋白酶对鲜蛹酶解后的蛋白收率都明显高于对干蛹的酶解收率，分别达到了66.67%和64.64%。在这2组试验中，分别还做了未加入蛋白酶的干蛹和鲜蛹的本底溶出蛋白对照，结果表明，在没有加入蛋白酶的对照组中，鲜蛹的本底水平几乎是干蛹的2倍。分析造成这种现象的主要原因是因为蚕蛹在烘干过程中，因为受到了较长时间的高温烘烤，导致了一部分蛋白质的变性，构象发生变化，溶解度降低。而鲜蛹直接冷冻保存，蛋白质构象保存较好。所以，鲜蛹的蛋白收率高主要是由于其本身的可溶性蛋白含量高造成的。同时，由图中也可以发现，在去除本底可溶性蛋白的基础上，风味蛋白酶组处理得到的水解蛋白含量略高于中性蛋白酶处理组。

图1　2种蛋白酶对蚕蛹蛋白收率的影响

2.2不同蛋白酶对蚕蛹蛋白水解度的比较

由图2可知，经过蛋白酶处理后，鲜蛹得到的蛋白水解液的水解度明显高于干蛹的蛋白水解液，这可能也是由于鲜蛹的可溶性蛋白含量高，与干蛹相比蛋白酶可作用的底物含量高。干蛹的蛋白质经过高温烘烤后变性，造成了结构的变化，不仅水溶性蛋白的含量减少，同时也使得蛋白酶的作用位点藏匿于结构中心，蛋白酶无法接触到剪切位点而造成水解度的降低。从蛋白酶作用的结果来看，中性蛋白酶酶解后的水解度略高于风味蛋白酶酶解后的水解度。

图2　2种蛋白酶对蚕蛹蛋白水解度影响的比较

3　结论

在中性条件下2种蛋白酶作用后鲜蛹水解蛋白液的蛋白收率和水解度均高于干蛹水解蛋白液。而无论是鲜蛹还是干蛹，风味蛋白酶水解后的蛋白收率高于中性蛋白酶，但水解度小于中性蛋白酶。所以，在实际应用中，应根据蚕蛹保存条件及对水解产品的要求选择合适的蛋白酶。

4　讨论

昆虫被称为21世纪最大的未开发的资源。中国具有几千年的养蚕历史，种类繁多，成本低廉。蚕蛹蛋白更是一种优质未被充分利用的蛋白质，蛋白质含量在干蚕蛹中高达50%，其中人体必需的8中氨基酸占到45%左右，且必需氨基酸与非必需氨基酸的组成合理、均衡，符合世界卫生组织/联合国粮食及农业组织（WHO/FAO）提出的标准模式［16-17］。但由于蚕蛹具有独特的蛹臭味，未经过深加工的蚕蛹在全国范围内食用量仍很少。

本试验中干蛹和鲜蛹分别采用2种蛋白酶进行酶解比较后发现，利用鲜蛹进行蛋白酶酶解后的水解蛋白液蛋白收率和水解度明显高于干蛹的水解蛋白液。分析这种结果很可能是由于鲜蛹和干蛹的保存方法差异造成的。干蛹由于长时间的高温烘烤，蛋白质加热时，其内部氢键断裂，导致蛋白质分子结构发生变化。最终造成了蛋白质变性而造成可溶性蛋白含量的减少，由于本身底物浓度低，所以也间接地造成了水解度较低的结果［18］。

在去除本底可溶性蛋白的基础上，风味蛋白酶组处理得到的水解蛋白含量高于中性蛋白酶处理组，但中性蛋白酶组处理的水解度略高于风味蛋白酶组。这可能是由于风味蛋白酶的外切肽酶活性较强，但内切酶的活性低于中性蛋白酶［19］。在中性条件下，用中性蛋白酶和风味蛋白酶水解鲜蛹可以显著提高蛋白收率和水解度。虽然鲜蛹的酶解结果优于干蛹，但干蛹的体积小，易保存，而鲜蛹的体积较大，保存条件要求高，否则容易腐败。并且通过鲜蛹试验发现，在酶解过程中，细胞内的油小体被蛋白膜包裹，以及磷脂和蛋白质极易乳化成乳状液，不易分离，如需分离油脂和包裹蛋白质需进一步增加破乳工序［20］。所以在实际应用中，应按蚕蛹的保存条件及对水解蛋白的需求选择合适的蛋白酶进行。

参考文献

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Two Enzymatic Hydrolysis Methods for Extraction of Silkworm Pupa Protein Under Neutral Condition

Zhang Lili, Zhang Yuping, Chen Ming, Dai Junjun, Wu Chuanhua, Fan Tao
（The Sericultural Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Science, Hefei 230061, Anhui, China）

Abstract:To explore an efficient and economic method for enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein, using fresh pupa and dried pupa as raw materials, the effect of neutral protease and flavourzyme on the degree of hydrolysis and protein yield was examined under neutral condition. The results showed that fresh pupa could obtain higher protein yield and higher degree of hydrolysis than dried pupa. The protein yield of enzymatic hydrolysis using flavourzyme was higher than that of neutral protease, but its hydrolysis degree was lower. This might be caused by the low endonuclease activity of flavourzyme. So the fresh pupas were preferred in practice and proper protease should be used according to different requirements of protein hydrolysate.

Key words:Silkworm Pupa Protein; Enzymatic Hydrolysis; Protein Yield; Degree of Hydrolysis

中图分类号：S886.9

文献标志码：A论文编号：cjas15090012

基金项目：安徽省农业科学院院长青年创新基金项目“蚕蛹蛋白生物活性肽抗氧化机理的研究”（15B0626）、“家蚕彩色茧中色素和丝心蛋白结合的反应机理研究”（13B0631）；安徽省农业科学院学科建设项目“蚕蛹蛋白的加工利用及其生理功效研究”（14A0607）；安徽省农业科学院科技创新团队项目“经济昆虫资源多功能利用创新与应用”（15C0606）；安徽省蚕桑产业技术体系专项（ahnycytx-16）；安徽省农业科学院博士科研启动基金项目“桑椹花色苷的提取纯化及对紫外线诱导氧化损伤机制的初步研究”；安徽省农业科学院种子工程项目“经济昆虫的种质资源保育与开发利用”（14D0606）。

第一作者简介：张丽丽，女，1984年出生，安徽合肥人，助理研究员，博士，研究方向：经济昆虫资源综合利用。

通信地址：230061安徽省合肥市霍山路15号，E-mail：llzhang818@163.com。 230061安徽省合肥市霍山路15号，Tel：0551-66826686，E-mail：fantao1116@163.com。

通讯作者：范涛，男，1962年出生，安徽太和人，研究员，硕士，研究方向：蚕桑资源综合利用。

收稿日期：2015-09-29，修回日期：2015-11-10。