猪血清对猪肺炎支原体培养影响的研究

郑铁鑫 张影 柴华 尹尧 付丽杰/哈药集团生物疫苗有限公司



猪血清对猪肺炎支原体培养影响的研究

郑铁鑫 张影 柴华 尹尧 付丽杰/哈药集团生物疫苗有限公司

一、材料

（一）菌株

1.猪肺炎支原体P-5722-3株，由美国硕腾动物保健公司提供，哈药集团生物疫苗有限公司保藏。

2.猪肺炎支原体P-5722-3株CCU阳性标准品（CCU检测），由美国硕腾动物保健公司提供，哈药集团生物疫苗有限公司保藏。

（二）完全培养基

1.培养基组分A：根据猪肺炎支原体P-5722-3株培养基配方要求，制备组分A。

2.培养基组分B：猪血清

3.猪肺炎支原体P-5722-3株完全培养基由培养基组分A与培养基组分B共同制备，培养基组分A由哈药集团生物疫苗有限公司采用无菌过滤方式制备，培养基组分B采用热灭活方式制备。

（三）无菌检验培养基

酪胨琼脂斜面（G.A）、硫乙醇酸盐酪胨汤（T.G）葡萄糖蛋白胨（G.P），均由本公司培养基班组提供。

（四）设备

恒温振荡器：上海世平实验设备有限公司SPH-211C

PH计： METTER TOLEDO FE 20C

二、方法

（一）试验方法

针对培养组分B，分别选择5种猪血清，进口猪血清1#（美国产）、进口猪血清2#（新西兰产）、国产猪血清3#、国产猪血清4#、国产猪血清5#，各2个批次，按培养基总量10%与培养基组分A制备成猪肺炎支原体完全培养基，进行平行培养试验，猪血清在使用前均采用56℃，30 min热灭活处理。

（二）培养方法

取猪肺炎支原体P-5722-3株菌株按10%接种完全培养基中，37℃振荡培养，每隔8 h检测一次PH值，当PH值接近6.8时，将检测时间缩短，直至PH值到达6.8左右时，取少量样品进行检测并传代培养，连续传代培养三代并分别进行无菌检验。

（三）菌液浓度测定方法

采用CCU法（颜色变化单位测定法），该方法是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计算微生物的相对含量，取51支无菌培养管，每一管装1.8 ml猪肺炎支原体完全培养基（含有酚红）；在第一管加入0.2 ml待测猪肺炎支原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2 ml加入到第二管，以此类推，10倍梯度稀释，直到最后一管，做好标记，进行五组；采用同样的方法对CCU阳性标准品进行稀释，最为阳性对照，取未接种的一管作为阴性对照，置于37℃振荡培养14～16 d，根据颜色变化情况计算CCU含量。

三、结果

1.进行3次5组平行试验，试验结果见表1、表2、表3。

（备注：猪肺炎支原体P-5722-3株CCU阳性标准品检测区间值在0.2×108ccu50/ml～1×108ccu50/ml）

2.五种猪血清摇瓶试验结果。

1.三组平行试验数据无较大性偏差，数据可信，可作为参考性依据。

2.通过分别选择2各批次血清进行对照试验，降低批次间血清差异影响因素。

3.通过表1、表2、表3可以看出，猪肺炎支原体P-5722-3株使用进口1#猪血清制备的完全培养基培养效果最好。

四、小结与讨论

1.美国产进口1#猪血清与新西兰产进口2#猪血清批间差异较小，在培养上表现均较好，尤其是美国产进口1#猪血清最为突出。

2.国产4#猪血清较国产3#猪血清与国产5#猪血清要好，但其批间差异较大。

3.猪肺炎支原体P-5722-3株菌株不管在进口血清还是在国产血清中，连续三代培养呈现培养结果（CCU）上升趋势。

4.通过三组平行试验，验证了猪血清作为培养组分B在培养过程中的重要性，选择出最为适合猪肺炎支原体P-5722-3株菌株生长的猪血清。

表1 五种不同血清制备的完全培养基培养后一代菌液浓度测定

表2 五种不同血清制备的完全培养基培养后二代菌液浓度测定

表3 五种不同血清制备的完全培养基培养后三代菌液浓度测定