陇蜀杜鹃叶中金丝桃苷提取工艺研究

梁俊玉，刘 晶，刘晶晶，胡 刚，杨 强，张 继

(1. 西北师范大学　生命科学学院,甘肃 兰州730070;2. 甘肃特色植物有效成分制品工程技术研究中心,甘肃 兰州730070)



陇蜀杜鹃叶中金丝桃苷提取工艺研究

梁俊玉1，刘 晶1，刘晶晶1，胡 刚1，杨 强1，张 继2*

(1. 西北师范大学生命科学学院,甘肃 兰州730070;2. 甘肃特色植物有效成分制品工程技术研究中心,甘肃 兰州730070)

摘要通过单因素和正交实验，提取陇蜀杜鹃叶中主要活性成分金丝桃苷，采用高效液相色谱法测定，确定金丝桃苷的最佳提取工艺。结果显示影响陇蜀杜鹃叶中金丝桃苷得率的主要因素是乙醇浓度，各因素影响顺序为乙醇浓度>料液比>提取温度>提取时间，金丝桃苷最佳提取工艺为：乙醇浓度50%、料液比1∶25、提取温度80 ℃、提取时间1 h，得率为0.68%。该方法提取陇蜀杜鹃叶中的金丝桃苷得率高，稳定性好，工艺可控性强。

关键词陇蜀杜鹃；金丝桃苷；提取工艺；高效液相色谱

陇蜀杜鹃(RhododendronprzewalskiiMaxim.)为杜鹃花科植物，又名青海杜鹃、金背杜鹃、野枇杷，藏药称为达玛，为常绿灌木，生于海拔2 900～4 300 m的高山林地中，常成林。在我国主要分布于陕西、甘肃、青海及四川等地，储量较大[1-3]。陇蜀杜鹃具有清肺泻火、止咳化痰作用，治疗咳嗽痰喘、老年慢性支气管炎等疾病[4-5]。陇蜀杜鹃叶中主要成分金丝桃苷[6]具有镇痛，抗氧化，保护心肌、肝脏作用，还具有抗乙肝病毒作用等，具有广泛药理活性和潜在的应用前景[7]。金丝桃苷存在于多种植物中，含量也不相同，其中含量较高的为贯叶连翘(1.02%～1.46%)， 云南山楂 (0.289%)， 地榆 (0.052%～0.291%)，黄蜀葵花(1.12%)，金华葵花(1.125%)，毛果杜鹃中(0.1565%)[8]。本实验采用乙醇热回流法提取陇蜀杜鹃叶中的主要活性成分金丝桃苷，并用HPLC法测定其得率，确定金丝桃苷最佳提取工艺，旨在为有效开发和合理利用陇蜀杜鹃资源提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1陇蜀杜鹃叶

陇蜀杜鹃叶采自甘肃省天祝县石门镇，海拔3 000 m，植物标本经西北师范大学晏民生副教授鉴定为杜鹃花科植物陇蜀杜鹃(RhododendronprzewalskiiMaxim.)。

1.1.2设备与试剂

戴安UltiMate3000高效液相色谱仪(美国，DIONEX公司)；电子天平；KW-水浴锅。乙醇、甲醇、石油醚(60～90 ℃)(以上试剂均为分析纯)，磷酸、甲醇(以上试剂均为色谱纯)。金丝桃苷标准品购自北京盈泽纳新化工技术研究院(批号：MUST-13080201)。

1.2方法

1.2.1提取方法

陇蜀杜鹃叶晒干，粉碎，过40目筛，放入圆底烧瓶并加入石油醚热回流提取，过滤，弃去石油醚提取液，取出药渣晾干。将已晾干的药渣样品准确称取1.00 g置50 mL圆底烧瓶中，加入一定浓度和体积的乙醇溶液，在一定温度下浸提一定的时间，过滤，滤液浓缩后，加入甲醇溶解，在50 mL容量瓶中定容，摇匀，用高效液相色谱分析仪测定金丝桃苷含量。

1.2.2实验设计

选定乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比作考察4因素，先进行单因素实验，找出每个单因素的最佳因素水平，再以每组因素最佳水平为参考，每个因素各取3个水平，采用L9(34)正交法进行实验，以提取液中金丝桃苷的含量为考察指标，确定从陇蜀杜鹃叶中提取金丝桃苷的最佳工艺。

1.2.3含量测定方法

1.2.3.1色谱条件色谱柱为Kromasil-C18柱；流动相为甲醇-0.5%磷酸水溶液(40∶60)；流速0.8 mL/min;柱温25 ℃；检测波长360 nm。

1.2.3.2标准曲线制备准确称取金丝桃苷标准品5 mg,置于25 mL容量瓶中。用甲醇定容至刻度，摇匀。分别吸取上述溶液0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，利用高效液相色谱分析仪分别进样进行测定，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，标准品浓度(mg/mL)为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程。

1.2.3.3精密度实验取“1.2.3.2”项下对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样5次，测定峰面积，计算精密度。

1.2.3.4重现性实验制备6份原药材供试液按上述色谱条件操作，测定峰面积，计算精密度。

1.2.3.5稳定性实验取同一浓度的对照品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h按色谱条件进行测定，测定峰面积，计算精密度。

1.2.3.6加样回收实验取已知含量的样品粉末适量，加入一定量的对照品，制备成6份供试品溶液按照上述测定条件进行含量测定，测定峰面积，计算精密度。

1.2.4提取工艺的单因素实验

1.2.4.1温度对提取效果的影响按照1.2.1所述的实验方法，分别设定提取温度为50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃，提取金丝桃苷，得到的样品液用高效液相色谱分析仪按“1.2.3.1”项下色谱条件测定并计算其金丝桃苷含量，选择出较适宜的浸提温度。

1.2.4.2乙醇浓度对提取效果的影响按照1.2.1所述的实验方法，分别用水、20%、40%、60%、80%、100%乙醇，提取金丝桃苷，测定并计算出金丝桃苷含量，选择出较适宜的乙醇浓度。

1.2.4.3料液比对提取效果的影响按照1.2.1所述的实验方法，分别用料液比(g/mL)为1∶5、1∶15、1∶25、1∶35，按上述方法提取金丝桃苷，测定计算出金丝桃苷含量，选择出较适宜的料液比。

1.2.4.4时间对提取效果的影响按照1.2.1所述的实验方法，分别浸提提取0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h，按上述方法提取金丝桃苷，测定并计算出金丝桃苷含量，选择较适宜的浸提时间。

1.2.5提取工艺的正交实验

以单因素实验中最佳水平为参考，每个因素各取3个水平，采用L9(34)正交法进行实验，以提取液中金丝桃苷的含量为考察指标，确定从陇蜀杜鹃叶中提取金丝桃苷的最佳工艺。

2结果与分析

2.1金丝桃苷标准曲线的绘制

利用高效液相色谱分析仪测定结果绘制标准曲线，〗见图1，得金丝桃苷标准曲线回归方程为：Y=1120.7X-02128，r2=0.9990,线性范围0.004～0.04 mg/mL。

2.2精密度分析

2.2.1精密度实验

对同一浓度的的对照品连续测定5次。RSD为1.06%，结果表明，该测定方法精密度良好。

图1　金丝桃苷标准曲线

2.2.2重现性实验

制备6份原药材供试液，分别测定，RSD为1.96%，结果表明，该测定方法重现性良好。

2.2.3稳定性实验

取同一浓度的对照品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进行测定，RSD为1.48%，结果表明，样品在12 h内稳定性良好。

2.2.4加样回收实验

取已知含量的样品粉末适量，加入一定量的对照品，制备成6份供试品溶液测定，加样回收率在98.06%～101.76%，RSD为1.84%。

2.3提取条件的单因素实验结果

2.3.1温度对提取效果的影响

改变浸提温度提取陇蜀杜鹃叶中金丝桃苷，结果表明，温度对提取效果影响不明显，综合考虑经济、节约等各方面因素，确定最佳浸提温度为70 ℃。

2.3.2乙醇浓度对提取效果的影响

采用不同乙醇浓度提取陇蜀杜鹃叶中金丝桃苷，结果表明，金丝桃苷得率开始时随乙醇浓度的增大而增大，当乙醇浓度60%时达到最大值，此后随着乙醇浓度的升高，金丝桃苷得率有所下降，因此从陇蜀杜鹃叶中提取金丝桃苷，采用60%的乙醇溶液为提取剂效果最好。

2.3.3料液比对提取效果的影响

采用不同料液比提取陇蜀杜鹃叶中金丝桃苷，结果表明，金丝桃苷得率随料液比的增大而增大，当料液比为1∶15时达到最大值，此后随着料液比的升高，金丝桃苷得率有所下降，因此从陇蜀杜鹃叶中提取金丝桃苷，料液比为1∶15是效果最好。

2.3.4时间对提取效果的影响

改变浸提时间提取陇蜀杜鹃叶中金丝桃苷，结果表明，时间对提取效果影响不明显，综合考虑经济、节约等各方面因素，确定最佳浸提温度为1.0 h。

2.4提取条件的正交实验结果

2.4.1正交因素水平表

以单因素实验中最佳水平为参考，采用L9(34)正交法进行实验，见表1。

表1　正交实验水平

2.4.2正交实验结果

正交实验结果见表2。影响陇蜀杜鹃叶中金丝桃苷得率的主要提取因素为乙醇浓度，各因素的影响顺序为乙醇浓度>料液比>提取温度>提取时间，提取最佳工艺组合为A3B1C3D2,即乙醇浓度50%、料液比1∶25、提取温度80 ℃、提取时间1 h，得率为0.68%。

表2　正交实验结果及统计学实验处理

3结论

对陇蜀杜鹃叶中的金丝桃苷进行乙醇热回流法提取，通过单因素实验、正交实验发现影响陇蜀杜鹃叶中金丝桃苷得率的主要因素是乙醇浓度。其最佳工艺组合为乙醇浓度50%、料液比1∶25、提取温度80 ℃、提取时间1 h，得率为0.68%。实验证明，最佳工艺的平均提取得率高，稳定性好，且工艺操作控制容易。

4讨论

本实验从陇蜀杜鹃叶中提取金丝桃苷得率可达0.68%。与贯叶连翘和黄蜀葵花、金华葵花中的金丝桃苷相比较，含量要低，但比其它植物中金丝桃苷含量高。且所用原料为植物叶，和黄蜀葵、金华葵所用原料花比较起来，资源量要大。陇蜀杜鹃在国内资源丰富、分布较为广泛，原料易得，并在采集其叶子后不会对植物造成伤害，从而在金丝桃苷的进一步开发和利用方面具有一定意义。

参考文献：

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志: 卷1 [M].北京:科学出版社,2004:214.

[2]青海植被编委会.青海植被[M].西宁:青海人民出版社,1989:52-56.

[3]杨永昌.藏药志[M].西宁:青海人民出版社,1991.

[4]陕西省革命委员会卫生局商业局.陕西中草药[M].北京：科学出版社,1971:19-21.

[5]中草药汇编编写组.全国中草药汇编[M].北京:人民卫生出版社,1975:24-26.

[6]梁俊玉,杜鑫雨,陈燕,等.金背枇杷叶化学成分研究[J].中药材,2014,37(8): 1381-1382.

[7]黄凯,杨新波,黄正明.金丝桃苷药理作用研究进展[J].医学导报,2009,28(8): 1046-1047.

[8]王燕,王先荣,马凤余,等.金丝桃苷在植物中的分布及其含量测定[J].安徽医药,2009, 13(11):1312-1315.

Study on Extracting Technique of Hyperin fromRhododendronprzewalskiiLeaves

Liang Junyu1, Liu Jing1, Liu Jingjing1, Hu Gang1, Yang Qiang1, Zhang Ji2*

(1.College of Life Science of Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China;2. Gansu Engineering Research Center for Effectire Component Products of Characteristic Plants,Lanzhou 730070, China)

AbstractHyperin fromRhododendronprzewalskiileaves was extracted By single factor and orthogonal experiments and measured by HPLC method. The optimum extract technique was determinated. The main factor that influenced the yield of extracting hyperin was alcohol concentration, the order of each factors is alcohol concentration > solvent ratio > temperature > extraction time, the best extract technique is that alcohol concentration was 50%, solvent ratio was 1∶25, temperature was 80℃ and extraction time was 1h. The yield is 0.6807%. The extract technique had the high yield.

Key wordsRhododendronprzewalskiiMaxim.; hyperin; extract technique; HPLC

doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2016.03.006

收稿日期：2015-10-28

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31200255) 。

作者简介：梁俊玉(1978—),男,硕士,副教授,研究方向：天然产物研究。E-mail:liangjunyu@nwnu.edu.cn * 通讯作者：张继,教授。E-mail:zhangj@nwnu.edu.cn

中图分类号：R284.2

文献标识码：A

文章编号：1006-9690(2016)03-0017-04