GnRH主动免疫雌性大鼠调控机制研究

曹晓涵，韩兴发，杜小刚，陈志渝，孟风艳，储明星，曾宪垠*

(1.四川农业大学生命科学学院，雅安 625014；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室，北京 100193)



GnRH主动免疫雌性大鼠调控机制研究

曹晓涵1，韩兴发1，杜小刚1，陈志渝1，孟风艳1，储明星2，曾宪垠1*

(1.四川农业大学生命科学学院，雅安 625014；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室，北京 100193)

摘要：旨在探讨GnRH主动免疫雌性SD大鼠的调控机制。24只雌性SD大鼠随机分为免疫组、卵巢切除组和空白对照组(n=8)，免疫组于12周龄注射疫苗，4周后加免；卵巢切除组11周龄外科手术摘除卵巢；空白对照组不作任何处理。使用放射免疫分析法测定血清激素E2、P4、FSH和LH含量，荧光定量PCR分析各基因mRNA表达情况。结果显示，主动免疫显著降低血清E2、P4、FSH和LH含量，至56周处死时，E2和LH含量有微弱上升，但4种激素含量均显著低于空白对照组(P<0.05)。与空白对照组相比，主动免疫显著下调下丘脑GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA，垂体GnRH-R、FSH-β和LH-βmRNA以及卵巢FSHR、LHR和ER-αmRNA的表达水平(P<0.05)。结果表明，GnRH主动免疫能显著抑制雌性SD大鼠性腺发育，降低血清性激素含量，通过下丘脑ER-αmRNA-GPR54/KiSS-1通路保持动物较长时间去势；但GnRH主动免疫造成的动物去势存在恢复的可能。

关键词：GnRH；主动免疫；调控；机制；雌性大鼠

由于存在发情行为，饲养雌性动物不仅难于管理，更有可能因为无计划怀孕带来诸多问题[1]；而对于雌性野生动物，对其进行避孕能更好的地控制动物数量，方便管理，也能减轻过度的动物数量给自然环境带来的压力[2]。研究表明，GnRH主动免疫雌性SD大鼠有很好的去势效果[3]：雌性SD大鼠接受GnRH主动免疫后直至16wpv(Weekspostvaccine)，抗体滴度仍保持较高水平，且血清生殖激素维持极低水平。但随着时间延长，接受GnRH主动免疫的雌性SD大鼠血清生殖激素、下丘脑-垂体-性腺轴各个生殖相关基因mRNA表达的变化规律还未见报道。本研究即对雌性大鼠主动免疫GnRH去势疫苗，考察初次免疫56周后其生殖激素和生殖相关基因的变化情况，探讨雌性动物GnRH主动免疫的调控机制，为GnRH主动免疫去势疫苗更广泛的应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

GnRH并列二聚体卵清蛋白复合物(本实验室合成)，反转录试剂盒、荧光定量PCR染料SYBRPremixExTaqTMⅡ(PerfectRealTime)、RNAisoPlus(TaKaRa公司)；LH、FSH、E2、P4碘[125I]放射免疫分析药盒(北京北方生物研究所人源性试剂盒)。

1.2动物选取、分组及处理

24只健康性成熟Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠，10周龄，体重180～220g(购自四川大学华西动物中心)，随机分为3组，分别是组Ⅰ、组Ⅱ、组Ⅲ(n=8)。组Ⅰ为免疫组(FemaleImmuneGroup，fIG)。12周龄时腿部肌肉注射1mL疫苗，4周后加免，加免时注射剂量及方法同初次免疫。组Ⅱ为卵巢切除组(Ovariectomygroup，OVX)。11周龄时进行手术。3%戊巴比妥钠，按照30mg·kg-1体重腹腔注射麻醉。麻醉成功后趴卧，常规消毒，备皮。在大鼠腰部肾区偏下中间位置(距离脊柱约1cm位置)开口，切除卵巢。术后前3d每天肌肉注射青霉素2万U，同时使用硫酸庆大霉素注射液冲洗伤口，观察伤口愈合情况。组Ⅲ为空白对照组(Controlgroup，Con)，不作任何处理。试验期间所有动物均按常规标准饲养，自由饮水和采食。

1.3样品采集及处理

初次免疫当天记为0wpv。初免当天起至8wpv每2周空腹尾尖采血1次，从第8wpv起每4周空腹尾尖采血1次，每次1.5mL，直至处死(56wpv)。所有血样于4 ℃放置过夜，3 500r·min-1，4 ℃离心15min，分离血清，-20 ℃保存，用于测定血清激素含量。

各组大鼠于56wpv(初免后第14个月)断颈处死，处死后迅速分离下丘脑、垂体，放入含1mLTrizol的EP管中4 ℃保存用于提取总RNA；fIG和Con分离双侧卵巢，去除脂肪组织，放入含1mLTrizol的EP管中4 ℃保存用于提取总RNA。

1.4血清激素含量测定

应用RIA测定雌鼠血清中FSH、LH、E2和P4含量，操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.5基因表达测定

使用苯酚-氯仿法提取各组织总RNA，电泳检测其完整性。完整RNA利用反转录试剂盒将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板在特定引物下进行定量检测，内参基因选择β-actin。每个样品3次重复。PCR程序：预变性95 ℃10s；变性95 ℃5s；退火延伸58～60 ℃25s；读取荧光值，共40个循环；熔解曲线分析(58～60) ℃直至95 ℃，每0.5 ℃恒温5s。目的基因mRNA相对表达水平采用标准曲线法进行计算，荧光定量PCR结果使用Bio-RadCFXManager2.1 分析软件处理。引物序列见表1。1.6统计分析

利用SPSS20.0软件对所测数据进行单因子方差分析，采用Duncan法进行数据间比较，结果以“平均值±标准误(mean±SEM)”表示。P<0.05表示数据差异显著。

表1　引物序列

KiSS-1.KiSSpeptin编码基因；GPR54.KiSSpeptin受体编码基因；GnRH.促性腺激素释放激素；GnRH-R.促性腺激素释放激素受体；LH-β.促黄体生成素β亚基；FSH-β.促卵泡生成素β亚基；LH-R.促黄体生成素受体；FSH-R.促卵泡生成素受体；ER-α.雌激素α受体；β-actin.β-肌动蛋白

KiSS-1.KiSSpeptinencodinggene；GPR54.KiSSpeptinreceptorencodinggene；GnRH.Gonadotropin-releasinghormone；GnRH-R.Gonadotropin-releasinghormonereceptor；LH-β.Luteinizinghormoneβsubunit；FSH-β.Folliclestimulatinghormoneβsubunit；LH-R.Luteinizinghormonereceptor；FSH-R.Folliclestimulatinghormonereceptor；ER-α.Estrogenαreceptor；β-actin.β-myosin

2结果

2.1RNA完整性

M.RNA marker;1～4.总RNA样品M.RNA marker;1-4.Tatol RNA samples图1　总RNA 1%琼脂糖凝胶电泳Fig.1　Total RNA electrophoresis with agarose gel(1%) image

1%琼脂糖凝胶电泳显示(图1)，提取的总RNA样品28S和18S条带清晰，5S条带基本可见，无DNA污染和降解，纯度符合标准，可进行后续试验。2.2血清激素含量

2.2.1雌鼠血清E2含量雌鼠血清E2含量如图2A所示，箭头表示免疫时间。fIG血清E2浓度在初次免疫后便急剧下降，6wpv时即处于检测限附近，显著低于Con(20.6～29.9pg·mL-1)(P<0.05)，并一直维持与OVX相同水平至48wpv，从52wpv时，E2含量出现微弱上升，至试验结束(56wpv)时，仍然显著低于Con(P<0.05)。OVX血清E2含量在0wpv时，即已处于极低水平，从2wpv开始低至不可测水平，显著低于Con(P<0.05)。

2.2.2雌鼠血清P4含量雌鼠血清P4含量如图2B所示，箭头表示免疫时间。Con血清P4含量整个试验期间保持较稳定状态，波动为15.97～21.91ng·mL-1。初次主动免疫后，fIG血清P4含量下降，加强免疫继续快速下降，至28wpv时低至不可测水平，显著低于Con(P<0.05)。与血清E2含量变化情况类似，OVX血清P4含量在0wpv时即已处于极低水平，从6wpv开始低至不可测水平，显著低于Con(P<0.05)。

2.2.3血清FSH含量雌性大鼠血清FSH含量见图2C，箭头表示免疫时间。在整个试验期间Con血清FSH含量维持平稳，波动为3.19～4.28mIU·mL-1。主动免疫引起雌性大鼠血清FSH含量下降，初次免疫后，第2周开始便显著低于Con(P<0.05)，从8wpv直至试验结束时的56wpv，血清FSH含量一直保持在不可测的低水平。OVX血清FSH浓度从手术后开始升高，显著高于Con(P<0.05)。

2.2.4血清LH含量雌性大鼠血清LH含量见图2D，在整个试验期间Con血清LH含量维持较平稳状态，在3.68～4.44mIU·mL-1波动。主动免疫引起雌性大鼠血清LH含量下降，初次免疫后，第2周开始便显著低于Con(P<0.05)，从8～40wpv，血清LH含量一直保持在不可测的低水平。从44wpv开始，血清LH含量缓慢上升，但是至试验结束时的56wpv，仍显著低于Con(P<0.05)。OVX血清LH浓度从手术后开始升高，显著高于Con(P<0.05)。

图2　雌鼠血清E2(pg·mL-1)、P4(ng·mL-1)、FSH(mIU·mL-1)和LH(mIU·mL-1)含量变化Fig.2　Serum E2，P4，FSH and LH levels of female rats

综上表明，主动免疫能显著降低雌性大鼠血清E2、P4、FSH和LH含量，并能保持长达56wpv。

2.3下丘脑-垂体-性腺轴生殖相关基因mRNA表达变化

2.3.1下丘脑生殖相关基因mRNA表达变化下丘脑生殖相关基因表达变化情况如图3a，试验56wpv时，观察到GnRH主动免疫显著下调雌性SD大鼠下丘脑GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA表达(P<0.05)；外科去势手术也同样显著下调下丘脑GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA的表达(P<0.05)。

2.3.2垂体生殖相关基因mRNA表达变化垂体生殖相关基因表达变化情况如图3b，试验56wpv时，观察到与Con相比，GnRH主动免疫显著下调雌性SD大鼠垂体GnRHR、FSH-β和LH-βmRNA表达(P<0.05)；而外科去势手术显著上调雌性SD大鼠垂体GnRHR、FSH-β和LH-βmRNA表达(P<0.05)。

2.3.3卵巢生殖相关基因mRNA表达变化卵巢生殖相关基因表达情况如图3c所示，试验56wpv时，观察到GnRH主动免疫显著下调雌性SD大鼠卵巢FSHR、LHR和ER-αmRNA表达情况(P<0.05)。

*.与空白组相比差异显著Compared to intact controls，* donates a significant difference图3　GnRH主动免疫对下丘脑、垂体和卵巢生殖相关mRNA表达水平的影响Fig.3　Effects of active immunization against GnRH on the mRNA expression levels of hypothalamic GnRH and ER-α

综上所述，GnRH主动免疫对雌鼠生殖相关基因mRNA的表达调控有显著的长期的影响：明显下调下丘脑GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA、垂体GnRH-R、FSH-β和LH-βmRNA以及卵巢FSHR、LHR和ER-αmRNA表达水平。而外科去势对雌鼠生殖相关基因mRNA表达调控有不同影响：显著下调下丘脑GPR54、KiSS-1、GnRH和ER-αmRNA；显著上调垂体GnRH-R、FSH-β和LH-βmRNA表达水平。

3讨论

有研究结果表明，接受GnRH主动免疫的动物其血清促性腺激素及性激素浓度[4-6]均有降低。本研究也得到相似结果。P4和E2是由卵巢分泌的重要孕激素和雌激素，本研究中免疫雌鼠血清P4和E2含量均显著低于空白组，显示达到了很好的免疫去势效果，这与GnRH主动免疫动物的研究结果一致[5，7]。并且，fIG和OVX血清P4和E2含量无显著差异(P>0.05)，表明在进行GnRH主动免疫56wpv后，fIG保持与去卵巢大鼠一样的去势效果。GnRH主动免疫雌鼠后，血清FSH、LH、P4及E2含量与空白对照组相比显著下降(P<0.05)，这与GnRH主动免疫动物的研究结果一致。

Kisspeptin-GPR54信号系统通过两种方式调节GnRH来控制排卵周期，位于下丘脑前腹侧室周核(AVPV)的kisspeptin神经细胞引发产生GnRH分泌峰，继而调控雌激素对GnRH的正反馈调节[8]；其余位于下丘脑ARC的kisspeptin神经细胞则参与GnRH的产生和雌激素对GnRH分泌的负反馈调节[9]。有报道研究E2对小鼠前脑KiSS-1系统的调节作用。位于弓状核的KiSS-1基因，在卵巢切除的小鼠中表达升高，在卵巢切除后，雌激素替代治疗的小鼠中表达降低：而位于前腹面室旁核的KiSS-1基因的表达正好与此相反。由此得出结论：位于弓状核的KiSS-1神经元可能在GnRH分泌的负反馈中起到一定作用，而位于AVPV的KiSS-l可能参与了GnRH分泌的正反馈调节，并且通过试验证实E2对KiSS-1的效应主要是通过ER-α介导的[10]。研究发现，下丘脑GnRH信号的上调可促进垂体FSH和LH合成和分泌，提高血液P4、E2浓度，从而改善母鹅繁殖性能[11]。反之，GnRH信号的下调则抑制垂体FSH和LH的合成和分泌，与本研究结果一致。垂体FSH和LH的合成与分泌受下丘脑直接调控，GnRH主动免疫降低下丘脑GnRH含量[12-13]，继而导致FSH和LH分泌减少。

去势的雄性恒河猴模型，青春期组KiSS-1mRNA表达明显高于少年组，但GPR54mRNA水平无差别；雌性恒河猴模型青春期组KiSS-1mRNA和GPR54mRNA水平都显著高于少年组，表明KiSS-1受体和配体共同参与中枢神经生殖内分泌调控[14]。本研究也得到一致结论：GnRH主动免疫后，下丘脑GPR54和KiSS-1mRNA表达水平均显著下降。

在垂体水平，本研究发现GnRG主动免疫56wpv后，GnRH-RmRNA和LH-βmRNA仍处于显著低于Con的水平，而FSH-βmRNA表达开始上升，接近Con，二者表达量无显著差异(P>0.05)。下丘脑正中隆起分泌的GnRH通过垂体门脉系统到达垂体前叶与GnRH-R结合产生生物学效应，刺激FSH和LH的合成和释放。有研究表明，对大鼠使用GnRH拮抗剂会下调垂体GnRH-RmRNA的数量[15]；另外，M.Lopot[16]等学者给母羊第三脑室灌注GnRH，观察到腺垂体中GnRH-RmRNA含量升高。这些结果说明垂体GnRH-RmRNA的数目的稳定维持需要GnRH激素参与，原因是GnRH的存在能够刺激GnRH-RmRNA的表达或增加GnRH-RmRNA结构的稳定性。垂体GnRH-RmRNA的数目的稳定维持需要GnRH激素参与，结合本研究结果可推测，主动免疫后，雌鼠下丘脑GnRH激素的分泌受到影响，至56wpv时，GnRH的分泌可能还未恢复至正常水平。

此外，GnRH主动免疫还显著下调了卵巢FSH-RmRNA和LH-RmRNA的表达(P<0.05)，与前人研究成果一致[17]。由此可推断GnRH主动免疫通过下调卵巢FSH-RmRNA和LH-RmRNA基因表达，降低卵巢FSH-R和LH-R数量，在性腺水平减弱甚至阻止FSH和LH对性腺自身发育的作用，达到去势效果。本研究还表明，卵巢ER-αmRNA表达显著低于空白组(P<0.05)，同样是因为外周低含量的E2影响其受体mRNA的表达[18-20]。

本研究结果显示，在进行主动免疫后的56wpv，雌性大鼠仍然保持很好的去势状态，这为将GnRH免疫去势疫苗推广到控制野生动物数量提供了较好的理论依据。由于野生动物在野外活动的不确定性[21]，为定时定点免疫造成了一定障碍。而本研究对雌性动物进行间隔仅一个月的两次免疫即可造成长达一年的去势状态。若能在动物的发情期之前有针对地对动物进行免疫，可以保证动物顺利度过发情期而不会导致怀孕。

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(编辑程金华)

RegulatoryMechanismsofActiveImmunizationagainstGnRHinFemaleRatsandItsMechanism

CAOXiao-han1，HANXing-fa1，DUXiao-gang1，CHENZhi-yu1，MENGFeng-yan1，CHUMing-xing2，ZENGXian-yin1*

(1.College of Life Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Key Laboratory of Farm Animal Genetic Resources and Germplasm Innovation of Ministry of Agriculture，Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China)

Abstract:ToexploretheregulatorymechanismsofactiveimmunizationagainstGnRHinfemaleSDrats.24adultfemaleSDratswereallocatedto3groupsof8animalseachrandomly.8ratswereimmunizedagainstGnRHat12weekofage，4weekslateranequaldoseboosterwasadministered.8ratsweresurgicallyovarictomyat11weekofagewhile8intactratswithoutanytreatments.Bloodsampleswerecollectedatday0(0wpv)untiljustbeforesacrificedat56wpv.SerumlevelsofFSH，LH，E2andP4weredeterminedusingRIA.Aftersacrificed，hypothalamusandpituitarywereremoved，themRNAexpressionsofreproduction-relatedgenesweredeterminedbyreal-timefluorescencequantitativePCR(RT-PCR)；Ovarieswereexcised，adiposetissueswereremoved，thenthemRNAexpressionsforreproduction-relatedgenesweredeterminedbyRT-PCR.AfterimmunizationtwiceagainstGnRH，theconcentrationsofE2，P4，FSHandLHinimmunizedratsshowedasignificantlylowerthanthatinControlgroup(P<0.05).Moreover，activeimmunizationagainstGnRHsignificantlydown-regulatedthemRNAlevelsofGnRH，GPR54，KiSS1andER-αinthehypothalamus，GnRH-R，FSH-β and LH-βinthepituitary(P<0.05)，aswellasFSHR，LHRandER-αinovaries(P<0.05).ThisstudyindicatedGnRHhadexcellentimmunogenicandwasagoodalternativeofsurgicalcastration.ActiveimmunizationagainstGnRHcauseanimalsinalong-terminfertilityorsterilitybythefeedbackloopofER-α- GPR54/KiSS-1，andthefertilityofimmunocastratedratsshowatendancytorecover.

Keywords:GnRH；activeimmunization；regulatory；mechanisms；femalerat

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.011

收稿日期：2015-05-27

基金项目：四川省科技厅国际合作项目(2012HH0013)；四川农业大学双支计划(00770107)

作者简介：曹晓涵(1984-)，女，四川成都人，讲师，博士，主要从事生殖免疫调控研究，E-mail：caoxiaohan2007@hotmail.com *通信作者：曾宪垠，研究员，主要从事动物生殖免疫调控研究，E-mail：xyzeng1966@163.com

中图分类号：S852.4

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)03-0502-07