烟草BY-2细胞生长和呼吸对不同类型酸雨的响应

刘 鹏，逄好胜，张萌萌，张秀丽，孙广玉

（东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）



烟草BY-2细胞生长和呼吸对不同类型酸雨的响应

刘 鹏，逄好胜，张萌萌，张秀丽，孙广玉

（东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）

摘要：为了直观探究不同类型酸雨对植物生理生长的影响，以烟草Bright Yellow-2（BY-2）细胞为试验材料，模拟不同pH值（1.5、2.5、3.5、4.5、5.5）下硫酸型酸雨（SAR）、硝酸型酸雨（NAR）及混合型酸雨（MAR），以期了解其对烟草BY-2细胞干重和呼吸的影响。研究表明，在不同酸度下，烟草细胞干重均低于对照，细胞呼吸出现紊乱变化，说明不同pH下的酸雨对细胞均有伤害，BY-2细胞的干重和呼吸有不良反馈，且不同酸度的伤害程度不一，强酸（pH值为1.5）下对细胞迫害性最强。因此，不同类型酸雨对植物有迫害性，迫害性大小为SAR>NAR>MAR。

关键词：酸雨；烟草BY-2细胞；pH；细胞干重；细胞呼吸

酸雨通常是指pH<5.6的雨雪或其他形式的降水［1］，在形成和降落时吸收大气中的二氧化硫（SO2）和氮氧化合物（NOx）等物质。酸雨被喻为“空中死神”，能够损害古迹、伤害作物、酸化水体和土壤、破坏森林等。研究表明，酸雨会影响植物的生长发育和作物的营养价值［2-4］，而且危害植物的功能代谢。酸雨作用于植物，会伤害植物的叶片以及叶片的生理功能，表现在对叶片细胞超微结构破坏和膜脂过氧化［5］。有研究发现，酸雨提高了植物细胞膜透性，增加了丙二醛(MDA)含量，却降低了防御氧化性的系统抗性能力［6］。强酸雨还会影响作物种子的萌发率以及对其叶片造成的损害程度［7］。

烟草BY-2细胞即为Bright Yellow-2细胞，该细胞不含叶绿体，呈亮黄色的悬浮体，烟草BY-2悬浮细胞采用改良的MS培养基进行暗培养，培养条件为恒温振荡器转速127 rpm、温度25℃±2℃。烟草BY-2细胞被Nagata等人所述来培养［8］。烟草BY-2悬浮细胞拥有独特的性质是较高的生长率（仅仅13 h就能够完成整个细胞的循环），通过根癌土壤杆菌同质性高和容易转换，最重要的是这些细胞能够同步化到相当高的程度。所有的这些特点使得烟草BY-2细胞成为研究植物细胞类的理想模型系统［9］。目前，有关酸雨的研究多数集中在整体植物上，或植物的某个器官或某个组织，如：叶片等。但是，以细胞为基础单元的研究鲜见报道。为此，本文以烟草BY-2细胞为研究材料，在模拟不同酸雨类型的环境条件下，通过烟草BY-2细胞生长和呼吸变化来探究酸雨对细胞的作用机理，为植物抵御酸雨危害提供技术支撑。

1　材料与方法

1.1试验材料

本试验在东北林业大学植物生理实验室进行，研究材料为烟草BY-2细胞，培养3d的烟草BY-2细胞为最佳材料。

1.2模拟酸雨的配置和处理

用0.15 mol·L-1CaCl2、0.12 mol·L-1MgCl2、0.21 mol· L-1KCl、0.15 mol·L-1NaCl、0.10 mol·L-1NaF和 0.55 mol·L-1NH4Cl配制各离子浓度的溶液［10］。硫酸型酸雨：将96%的硫酸加入上述配置好的各离子浓度的溶液，配成pH=1的母液，母液调制成pH值分别为1.5、2.5、3.5、4.5和5.5的硫酸型酸雨溶液。硝酸型酸雨：将65%的硝酸加入上面配好的各离子浓度的溶液，其他配制同硫酸型酸雨溶液。混合型酸雨：按照硫酸（96%）与硝酸（65%）质量比1:1，配成pH=1混合型母液，然后用此母液配成pH值分别为1.5、2.5、3.5、4.5和5.5的混合型酸雨。

2　试验方法

2.1试验处理

将培养3d的烟草BY-2细胞在分析天平上称取1g放于锥形瓶中，每瓶各加入改良的MS培养基10mL，pH值为1.5、2.5、3.5、4.5和5.5的硫酸型、硝酸型以及混合型酸雨溶液各取500μL，分别加入锥形瓶中。以不加入酸雨而加入去离子水作为对照（CK）。每个处理进行3次重复。

2.2测定方法

2.2.1细胞干重测定

烟草BY-2细胞经酸雨溶液处理1d、2d、3d和4d后，用200目细胞筛过滤去除液体得到细胞后放入60℃烘箱中烘干，烘干至恒重后称取细胞干重（mg）。

2.2.2烟草BY-2细胞呼吸速率的测定

经3种酸雨溶液分别处理3h、6h和9h后的烟草BY-2细胞，利用 Chlorolab-2液相氧电极（英国Hansatech公司） 测定烟草 BY-2细胞呼吸速率（μmolO2/mL/min）。

2.2.3DNA凝胶成像

经3种酸雨溶液处理24h后用天根植物DNA试剂盒提取烟草BY-2细胞的DNA，利用琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行电泳，然后进行成像分析。

2.3统计分析

利用Excel 2003对数据结果进行处理，平均值间的比较通过DPS软件的单因素方差分析法(One-way ANOVA)。

3　结果与分析

3.1模拟酸雨对烟草BY-2细胞干重的影响

图1　烟草BY-2细胞在模拟酸雨处理下的干重Fig.1　The dry weight of tobacco BY-2 cells under simulated acid rain treatments

图1显示，随着培养天数的增加，未经酸雨处理的烟草BY-2细胞（CK）的干重逐渐增加，而经过3种酸雨处理的烟草BY-2细胞干重逐渐降低，且处理后的烟草BY-2细胞干重与CK差异显著。硫酸型酸雨处理烟草BY-2细胞（图1-A）显示，pH=1.5的酸雨，处理后1d细胞干重就降低了77.32%，而pH为2.5～5.5的酸雨处理的细胞干重降低幅度均小于pH=1.5处理的降低幅度，pH为2.5、3.5、4.5和5.5处理的细胞干重分别较CK降低了17.55%、10.56%、2.14%和15.12%。随着处理时间的增加，硫酸性酸雨处理烟草BY-2细胞的干重降低程度加大，pH为2.5、3.5、4.5和5.5的酸雨处理第4d的细胞干重比CK分别降低了92.22%、88.02%、92.49%、83.03%和80.82%。硝酸型酸雨处理烟草BY-2细胞（图1-B）的结果与硫酸型酸雨表现的趋势基本一致，不同之处是pH=1.5的硝酸型酸雨处理的烟草BY-2细胞干重所降低的程度要小于相同pH值下硫酸型酸雨处理的细胞干重降低程度，混合型酸雨处理烟草BY-2细胞（图1-C），其干重变化与硫酸型酸雨相似。

3.2模拟酸雨对烟草BY-2细胞呼吸速率的影响

图2　烟草BY-2细胞在模拟酸雨处理下的细胞呼吸Fig.2 The cellular respiration of tobacco BY-2 cells under simulated acid rain treatments

由图2所示，3种不同类型的酸雨处理烟草BY-2细胞，其细胞的呼吸速率表现出不同的变化。硫酸型酸雨处理烟草BY-2细胞，pH=1.5酸雨明显降低了细胞的呼吸速率，与CK差异显著（图2-A）；pH为2.5、3.5、4.5和5.5处理的烟草BY-2细胞的呼吸速率明显增加，与CK比较差异显著，并且随着处理时间的增加，呼吸速率变化不大。硝酸型酸雨处理的烟草BY-2细胞呼吸速率变化同硫酸型酸雨相似（图2-B）。混合型酸雨明显降低了烟草BY-2细胞呼吸速率（图2-C），pH=1.5的处理明显降低了细胞的呼吸速率，而且处理时间越长，呼吸速率降低越明显，酸雨处理6h和9h呼吸速率非常低，分别较CK降低了94.07%和94.20%。3.3模拟酸雨对烟草BY-2细胞DNA的影响

由图3所示，不同酸度处理的BY-2细胞的DNA均是2 000bp。pH=1.5的DNA片段最少，其次DNA片段少的是pH=2.5、pH=5.5、pH=3.5，pH=4.5的DNA片段较多（图3-A）。pH=5.5的DNA片段较其他处理的DNA片段要少很多（图3-B）。pH=1.5处理的DNA片段较少，其他处理的DNA片段较多（图3-C）。

图3　烟草BY-2细胞在模拟不同类型酸雨处理下的DNA图像Fig.3　The DNA images of tobacco BY-2 cells under simulated acid rain treatments

4　讨论

本实验的结果通过图1显示，由于细胞随着时间是不断生长的，因此CK组的细胞干重随着处理天数是不断增加的，而模拟三种酸雨处理组的细胞干重百分比随着时间均下降，细胞的干重较CK比较处于没有增长的趋势且与CK间存在显著性差异（p<0.05），由此表明三种酸雨对细胞的生理均有伤害性，会抑制细胞的正常生长，因此可以表明酸雨会影响植物的正常生长、阻碍生长发育、降低生长量和产量［11］。由图2表示，模拟三种酸雨的pH 1.5处理的细胞呼吸与其他处理和CK存在显著性差异（p<0.05），强酸对细胞的伤害作用更剧烈，且SAR各处理的细胞呼吸要明显高于NAR与MAR，而三种酸雨pH 2.5~pH 5.5的处理细胞呼吸随着时间出现了先升高再降低或先下降后升高的变化，细胞呼吸出现紊乱，代表着处理对细胞正常的生理有一定的干扰作用，呼吸的升高和呼吸的紊乱都将大幅度地消耗细胞的能量和物质，而MAR处理组的呼吸速率降低了，可能氮与硫元素的混合对植物有一定益处。结合图3中DNA的图像，随着酸雨酸度的增加，对烟草BY-2细胞的伤害逐渐明显，尤其是重度酸雨下，细胞的DNA片段明显减少，说明细胞大量死亡，遗传物质遭到破坏，进而细胞的干重与呼吸速率均大幅度下降，但是NAR与MAR不是严格按照酸度增加而伤害性增强，在pH2.5时的伤害性小于pH5.5，可能加入氮元素在pH2.5的酸度下对植物细胞有益处，减小了酸雨对细胞的伤害性。此实验后续将要对模拟酸雨处理下的烟草BY-2细胞进行观察以及对细胞中的酶等进行测试，通过生理指标综合的进行比较分析，同时对烟草BY-2细胞的其他受迫害性条件进行合理的探索。

综上所述，通过图1、2和图3以及细胞干重、细胞呼吸百分比的比较，模拟三种酸雨酸雨各个处理对细胞伤害比较且通过比较，三种不同酸雨迫害性大小为：SAR>NAR>MAR。通过对细胞的直观实验，可推出酸雨对植物的的生理生长均有迫害性，对植物的生理产生有一定的不良影响，长时间生长在酸雨地带，植物的各种生理指标均会出现异常，影响植物生长发育甚至死亡，因此要保护环境减少污染。

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The response of tobacco BY-2 cells on weight and respiration under
simulated acid rain of different types of treatments

LIU Peng,PANG Hao-sheng,ZHANG Meng-meng,ZHANG Xiu-li,SUN Guang-yu
(School of Life sciences,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

Abstract:To understand the effects of different types of acid rain on plant growth and physiological,Tabacco bright yellow-2 (BY-2)cells were used as the experimental materials to study the effects simulated sulfuric acid rain(SAR),nitric acid rain (NAR)and the mixed acid rain(MAR)on physiological characteristics in different pH values(1.5、2.5、3.5、4.5、5.5),the results showed that the dry weight of cells decline to compare with control in different acidities,The cellular respiration appeared unstable situation,the content of DNA is different in DNA images,illustrated that simulated acid rain is harmful to cells,and had bad influence of BY-2 cells on weight and respiration,strong acid(pH 1.5)is the most harmful and persecution is different in different acidities.Conclusion:acid rain of different types are harmful to plants,the persecution: SAR>NAR>MAR.

Key words:Acid rain;Tabacco BY-2 cells;pH;Cells dry weight;Cellular respiration;DNA

中图分类号：Q814

文献标志码：A

文章编号：1674-8646（2016）08-0010-04

收稿日期：2016-01-07

基金项目：黑龙江省自然科学基金重点项目（ZD2011-05）

作者简介：刘鹏(1990-)，女，辽宁庄河人，硕士，主要从事植物生理与生态研究。

通讯作者：孙广玉(1963-)，男，黑龙江巴彦人，博士，博士研究生导师，教授，主要从事植物生理学研究，email:sungy@vip.sina.com。