不同固定条件对几种植物样品超微结构的影响

李叶　黄华平　邓睿　张新春　崔艳梅　卢雪莲　林培群

摘 要 为比较几种固定条件对不同植物材料样品电镜超微结构图像清晰度的影响。以3个不同科属4种植物[油棕（Elaeis gineansis Jacq.）、拟南芥（Arabidopsis thaliana.）、花生（Arachis hypogaea Linn.）、柱花草（Stylosanthes guianensias Sw.）]为研究主体代表，探讨了2.5%戊二醛与4%戊二醛固定过夜、锇酸固定2 h及过夜的制备方法对其叶片超微结构的影响，并成功观察了柱花草接种胶苞炭疽野生型菌株CH008后的病菌侵入过程。结果表明：油棕、拟南芥、花生及柱花草叶片经4%戊二醛与1%锇酸固定液固定过夜，其组织成像的效果均較为理想，各种细胞器整体信息丰富、结构组织完好、线条清晰。表明，此制备方法能够较好的保存植物叶片和细胞组织，提高制样的成功率及观察分辨率。

关键词 透射电镜；植物样品；制备方法；超薄切片；分辨率

中图分类号 Q944 文献标识码 A

透射电镜具有的高分辨率，直观性的特点，是研究微观组织结构的强有力工具，在农、林等科研上越来越得到重视和广泛应用。目前已在植物保护，良种繁育，植物品种鉴定、性状鉴别，成分分析，土壤改进，环境保护等多方面的科研中取得了显著成绩[1]。例如应用电镜观察植物组织的超微结构，探讨其生长和发育机理，揭示植物结构与功能的关系，为改善植物功能和提高植物产量提供理论依据[2-7]；观察植物器官在生长过程中的变异，为提高栽培技术提供依据[8-12]。而透射电镜不能像光学显微镜一样，可直接观察活体样品及经某些简单的方法制得的样品厚切片，它需对动物或植物组织进行固定、漂洗、脱水、浸透、包埋、聚合、切片及染色等处理。由于步骤繁琐，操作复杂，生物组织和细胞结构形态很可能发生某些变化。因此，在用透射电子显微镜观察生物样品前必须适当处理，根据实验材料寻找合适的处理条件，使样品损失程度最小，以求获得较好的、较真实的观察结果。

而固定是续取样之后的第二步，同时也是电镜生物样品制备过程中最关键一步，甚至能影响观察结果的成功与失败[13-14]。固定的目的一是为了使组织在电镜超薄切片制作过程中保持细胞的形态结构，使之各方面尽可能地接近于存活时的原有形态和结构，二是防止在以后的制备过程中，如脱水、渗透和包埋等丢失，并使其结构在电镜下有较好的反差。固定的好坏将直接影响到最后的结果，倘若材料固定不理想，就是再高的分辨率也是毫无意义的。只有良好的固定，才有可能获得真实而又优美的形态学图像。

但对于植物材料而言，由于植物细胞壁坚厚，致密组织，组织内空气多或表面含蜡等因素，都会影响固定液的渗入，从而影响固定效果。目前，国内虽有不少关于植物样品电镜制备技术的报道[15-18]，但还未发现针对不同或同一的植物材料，有相同或统一的固定条件处理方法。尤其是对一个电镜工作者，面临着既要缩短科技人员的实验时间，又要保证实验顺利进行，同时又获得较真实、较好的实验效果的问题。如果采用同一固定液成份、固定浓度及固定时间等固定条件，相同去处理大多科属植物材料，是否也都能取得良好的固定效果或之间有又怎样的关联？为此，探讨不同科属、同科不同属或同属不同种科属的植物材料，是否能采用统一的固定条件处理或建立一整套技术流程，既能提高工作效率，又能获得较真实、高分辨率结构图像是电镜工作者深入研究的重要内容。因此，本研究拟在前人研究的基础上，以棕榈科油棕和十字花科拟南芥2种植物材料为例，希望通过不同的固定条件方法处理，对最后获得的超薄切片电镜观察结果进行分析比较，筛选出最优固定条件方法，最后通过同豆科不同属植物花生和柱花草2种植物材料证明该固定条件下取得的效果，为电镜初学者和农业科技工作者开展相关研究提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料

植物样品：棕榈科油棕（Elaeis guineensis Jacq.）叶片；十字花科拟南芥[Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.]叶片；豆科花生（Arachis hypogaea Linn.）叶片；豆科柱花草（Stylosanthes guianensias Sw.）叶片。

试剂：25%戊二醛固定液（中镜科仪）、锇酸0.5 g（中镜科仪）、树脂Epon 812（中镜科仪）

仪器：DHG-9203A电热鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；LEICA EM UC6型超薄切片机，德国LEICA公司；HT-7700透射电子显微镜，日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理 用剪刀将植物样品沿叶脉方向剪成约0.5 mm3，迅速置于已预冷的戊二醛固定液中，并用注射器反复抽气，直至样品沉入固定液里，放入4 ℃冰箱过夜保存。次日，用0.1 mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗干净后，在1%锇酸固定液固定并于4 ℃冰箱中保存，再用0.1 mol/L磷酸缓冲液（PBS）清洗干净。样品预处理过程如表1所示。

1.2.2 脱水 将上述预处理样品分别经30%、50%、70%、80%、95%、100%乙醇梯度脱水10～20 min，100%无水丙酮脱水2～3次（每次10～20 min）。样品若不能在当天进行渗透，可在70%乙醇中浸泡并置于4 ℃冰箱过夜。

1.2.3 渗透、包埋 采用丙酮，包埋剂为3 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 3梯度渗透法浸透，分别浸透2、3和24 h。然后分别在35 ℃烘箱中静置12 h，45 ℃烘箱中静置24 h，60 ℃烘箱中静置48 h。

1.2.4 透射电镜观察 油棕、拟南芥及柱花草叶片组织经LEICA EM UC6型超薄切片机切片50～70 nm，自然晾干后，直接于HT-7700透射电镜观察；花生叶片组织经LEICA EM UC6型超薄切片机切片65 nm，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，待晾干后，HT-7700透射电镜观察。

2 结果与分析

2.1 不同植物叶片的超微结构

2.1.1 油棕叶片的超微结构 油棕叶片较厚，细胞壁厚，组织坚硬，药物难以渗透，是透射电镜样品制备难度大的典型。油棕超微结构如图1所示。从图1可看出，经4%戊二醛和1%锇酸固定过夜处理后的超微结构图像（图1-a～g）稍优于4%戊二醛和1%锇酸固定2 h处理后的超微结构图像（图1-h～i），但彼此间差异不显著，各种细胞器、结构均比较清晰、完整，且都能清晰观察到叶绿体片层精细结构；而经2.5%戊二醛和1%锇酸固定过夜处理后的超微结构图像效果不如前2种处理方法（图1-j～k），其叶绿体片层精细结构、细胞膜结构线条清晰度均有所下降。

2.1.2 擬南芥叶片的超微结构 拟南芥叶片含有丰富的液泡组织，在溶液中叶片难以下沉，也是较难固定的植物电镜样品之一。试验结果超微结构见图2。从图2-a～d可以看出，拟南芥叶片经2种方法处理后，其组织均有较理想的成像效果，且彼此间无差异，各种细胞器整体信息丰富、结构保存良好，固定彻底，渗透均匀，没有污染、肿胀、变形、颠颤、开裂等不良现象，结构清晰，可见叶绿体的全貌和叶绿体片层结构，同时能进行大视野结构观察。说明此制备方法，对拟南芥叶片的损伤较小。

2.1.3 花生叶片组织的超微结构 花生叶片样品试验结果超微结构见图3。从图3-a～d可看出，经4%戊二醛与1%锇酸固定处理的样品，组织结构整体信息丰富，各种细胞器结构比较清晰、完整，叶绿体的全貌和叶绿体组织的片层结构清晰（图3-a，b）。同时高尔基体、线粒体、液泡等均保存良好，微细的内质网也完整保留下来（图3-c，d），线粒体内外膜完整，脊清晰，线粒体膜、细胞核和细胞器的双层膜结构完整，没有变形或断裂。可见，此制备方法对花生叶片的损伤较小，也适合于豆科植物材料的制备，不仅能够提高豆科植物样品的分辨率，还能使切片显示更多的微细结构。

2.2 柱花草接种CH008菌后叶片组织超微结构

柱花草叶片样品试验结果超微结构见图4。接种24 h后叶片组织可见侵染钉（图4-a），侵染钉穿过细胞壁侵入寄主细胞，形成侵染菌丝定植于寄主细胞（图4-b），接种后48 h，菌丝在寄主细胞内蔓延（图4-c），接种后96 h，寄主细胞的超微结构变化明显（图4-d），叶绿体基本崩解，淀粉粒数目增多，细胞核核膜完全裂解，线粒体嵴开始发生退化，内部显空虚。试验结果表明此制备方法可成功观察CH008野生菌侵入柱花草的过程。

3 讨论

想获取高质量的透射电镜超薄切片及超分辨率的电镜图片，与样品的取材、固定、脱水、渗透、包埋和切片等制样步骤息息相关，任何步骤出问题都会影响样品超薄切片质量，甚至导致制样失败[19]。那么超薄切片质量的衡量标准首先是判断样品结构保存是否良好。而认定样品结构的保存质量，则主要是依据细胞细微结构形态判断。样品固定效果好的细胞，在电镜下可清晰观察到细胞膜、细胞核和细胞器的双层膜结构完整连续，没有变形或断裂，且双层膜中间的间隔大小均匀一致，特别是线粒体结构，内外膜完整，基质致密，脊清晰，核染色质分布均匀等[20]。植物材料由于植物的细胞壁较厚，结构密集，生物形态特征、细胞结构以及细胞内含物等与其他生物有很大的差异，导致植物电镜样品的制备往往比其他的生物样品制备更难以制备出高分辨的透射电镜样品[21-22]。本试验采用的棕榈科植物油棕叶片最厚，细胞壁坚硬，属于最难固定的样品之一，试剂最难以渗透；其次是十字花科拟南芥植物，拟南芥叶片含有较丰富的液泡组织，在溶液中难以下沉；而豆科植物相对前两科植物来说，药物较溶液渗透，且固定效果是最佳的。

杨勇骥[19]认为固定是标本制备过程中极为关键的一步，也是一种复杂的化学过程。某种组织应用哪种固定液、用哪一种缓冲液、用多少浓度、固定液的pH值及固定的时间和温度等，都要经过预实验。其中的每个因素都会影响固定的效果。组织细胞中蛋白质之间的交联受固定液浓度影响较大。一般电镜生物样品的固定液常用浓度范围是1%～6%，锇酸用1%～2%[19]。若固定液浓度过低，则需较长时间固定，这易引起组织中酶的扩散，造成细胞物质的抽提及组织的肿胀。过高浓度固定液，尤其氧化固定剂类（如锇酸和高锰酸钾）易造成蛋白质分子的断裂，损坏酶活性和细胞结构，使细胞过度收缩[19]。徐伯森[15]等采用3%戊二醛固定液固定2 h以上，锇酸固定5 h处理拟南芥，结构清晰，没有污染、肿胀、开裂等不良的现象出现。本实验中采用4%戊二醛固定液固定过夜，1%锇酸固定液固定过夜处理，也取得较佳的效果。

在理论上，低温能降低酶的活性，减少细胞自溶和胞内物质的抽提，而室温固定，则可加速固定液渗入组织的速度，且能增加固定剂与细胞组分之间的化学反应，但高温（室温）也能加速组织自溶。但在实践中，室温固定和低温固定之间难以发现显著的差别[20]。为了降低酶的活性、减少细胞自溶及胞内物质的抽提，目前多数实验室把大部分样品在0～4 ℃下固定。而确定合适的固定时间对固定效果也十分重要。因化学固定剂引起的抽提作用是随时间延长逐渐积累的，若组织固定时间过长，也会造成某些成分抽提。尤其是组织经锇酸长时间固定，会引起脂蛋白复合体的溶解，造成组织变脆，给超薄切片带来困扰。刘仁林[16]等对双子叶植物和单子叶植物采用2.5%戊二醛固定液在0～4 ℃条件下保存固定12～48 h，1%锇酸固定液在-4 ℃条件下后固定12 h的预处理方法处理，不同类群的各种细胞器如质膜、叶绿体、前质体、油滴、液泡等都得到较好的保存；毛晓霞[17]等对红枫叶片采用2.5%戊二醛固定液先4 ℃放置2～3 h，后在冰箱固定过夜，用1%锇酸固定时间不超过4 h，细胞整体信息丰富，各种细胞器保存良好，没有断裂的细胞膜，细胞质基质分布均匀，细胞核清晰可见。本实验同是在4 ℃下保存固定，但在对油棕植物材料的多次超薄切片实验中，发现油棕切片上出现有波浪型条纹、颠痕或开裂现象较多，可能是由于脱水不彻底或树脂受潮偏软，或渗透不够充分有关。

本试验采用不同固定条件处理棕榈科油棕和十字花科拟南芥样品，结果表明，采用4%戊二醛与1%锇酸固定液双重固定过夜的方法，样品组织得到的超微结构效果均较理想，细胞结构线条清晰，整体信息丰富、细胞质基质中充满均匀精细颗粒，未见明显空泡和颗粒性凝集现象。还通过了两种豆科不同属植物花生及柱花草样品证明该方法的适合性，结果发现样品组织结构也得到良好保存，连微管、内质网等微细结构也完整保存下来，各细胞器清晰可见。说明这种方法适应于棕榈科、十字花科、豆科植物的电镜样品制备，可以在实践中应用，并能获得较好的效果。

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