刺激响应性聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶的制备及性能研究

关键词：N-乙烯基己内酰胺(VCL)；水相沉淀聚合；纳米凝胶；还原降解；细胞毒性

聚合物纳米凝胶是一类内部具有交联网络结构、在溶剂中溶胀、不溶解、能够稳定分散的聚合物纳米粒子。聚合物纳米凝胶由亲水性聚合物或环境敏感性聚合物组成，通过对环境的响应，发生相应的膨胀或收缩[1]。温度是研究最广泛的环境刺激因素之一，如果凝胶网络内的聚合物具有温度响应性，则会表现出温度敏感的相转变行为[2]。聚N-乙烯基己内酰胺(PVCL)是近年来被人们广泛研究的温度响应性聚合物之一，与聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)相比，PVCL具有相似的温度响应性和更好的生物相容性[3-4]，被广泛用于组织工程和药物载体。PVCL纳米凝胶的体积相转变温度(VPTT)为31～38 ℃，在制备过程中可通过共聚亲水性或者疏水性单体调节[5]。

水相沉淀聚合具有操作简便、绿色环保、制备的粒子均匀且尺寸小等优点，是制备温度响应性聚合物纳米凝胶的常用方法之一[6]。通过引入环境敏感、可断裂的交联点，赋予聚合物纳米凝胶生物降解性、提高聚合物纳米凝胶的生物相容性[7-8]。细胞内还原性谷胱甘肽(GSH)的浓度为2～10mmol·L-1，远大于细胞外GSH的浓度(2～10μmol·L-1)[9]，因此细胞内外存在还原势的差异。二硫键在人体的正常体温、pH值和氧化等环境下非常稳定，而在一定量的谷胱甘肽还原酶或二硫苏糖醇(DTT)等还原剂存在下易被还原生成巯基[10]。因此，含有二硫键交联剂的聚合物纳米凝胶在进入还原势较低的细胞内时二硫键会发生断裂，导致降解。

作者采用水相沉淀聚合方法制备了刺激响应性PVCL纳米凝胶，并对其进行了动态光散射(DLS)、红外光谱(FTIR)、拉曼光谱(Raman)、透射电镜(TEM)表征，考察了交联剂和亲水性共聚单体对其性能的影响，研究了交联剂为N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)或N,N′-双(丙烯酰)胱胺(BAC)的PVCL纳米凝胶粒子在还原性环境中的降解性及细胞毒性。

1实验

1.1试剂与仪器

N-乙烯基己内酰胺(VCL，质量分数99%)、BAC(质量分数98%)、盐酸阿霉素(98%),百灵威科技有限公司；MBA(质量分数99%)、二硫苏糖醇(DTT，质量分数99%)、溴化噻唑蓝四氮唑(MTT，质量分数98%)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；甲基丙烯酸(MAA，质量分数99%，减压蒸馏)、过硫酸钾(KPS，质量分数99%，在水中重结晶)、碳酸氢钠(质量分数99%)、十二烷基硫酸钠(SDS，质量分数99%)、N,N′-二甲基亚砜(DMSO，质量分数99%)，国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

MalvenNano-ZS90型动态光散射仪，英国马尔文仪器有限公司；HitachiH-600型透射电子显微镜，日本Hitachi公司；UV-VisLambda35型紫外可见吸收光谱仪，美国Lambda公司；AVANCEⅢ型Bruker500MHz核磁共振波谱仪，瑞士Bruker公司；NicoletNexus-440型傅立叶变换红外光谱仪，美国Nicolet公司；LabRam-1B型拉曼光谱仪，法国Dior公司；EL311型酶标免疫检测仪，美国BioTek公司；3164型水套式CO2培养箱，美国FormaScientific公司。

1.2方法

1.2.1PVCL纳米凝胶的制备

准确称取一定质量的VCL、MAA、溶解于2 mL DMSO 的MBA/BAC及40 mg SDS、25 mg NaHCO3，溶解于100 mL双蒸水后加入配有球形冷凝管的150 mL三口烧瓶中，于200 r·min-1下搅拌，向体系中持续通入氮气，使反应一直处于惰性环境。通氮气0.5 h后，升温至70 ℃并稳定10 min，快速加入2 mL浓度为12.5 mg·mL-1的KPS水溶液，开始聚合反应。6 h后停止加热，保持氮气环境冷却至室温。最后将产物转移到截留分子量为14 000 Da的透析袋中，透析7 d以除去未反应的单体和其它杂质。改变VCL、MAA、MBA/BAC的用量以制备不同粒径的PVCL纳米凝胶。合成路线如图1所示。

1.2.2PVCL纳米凝胶的表征

采用动态光散射仪测定PVCL纳米凝胶的粒径；采用透射电镜观察其形貌；通过FTIR、Raman表征其结构。

1.2.3PVCL纳米凝胶的温度与pH值响应性实验

采用动态光散射仪测定PVCL纳米凝胶的粒径随温度、pH值和MAA用量的变化，研究PVCL纳米凝胶的温度与pH值响应性行为；通过测定PVCL纳米凝胶在25 ℃时电势随MAA用量和环境pH值的变化，研究PVCL纳米凝胶的pH值响应性。所测PVCL纳米凝胶的浓度为1.0 mg·mL-1。

1.2.4PVCL纳米凝胶的还原降解实验

采用动态光散射仪测定PVCL纳米凝胶在还原介质DTT中的散射光强随时间的变化，分析其还原降解行为。分别配制pH值为6.5、7.4、8.3的DTT浓度为10 mmol·L-1的磷酸盐缓冲溶液，加入少量P(VCL-MBA-MAA)或P(VCL-BAC-MAA)纳米凝胶置于37 ℃空气浴中，在设定时间取出少许样品直接用动态光散射仪测定散射光强。通过计算不同时间点的散射光强与初始散射光强的比值，分析降解过程中PVCL纳米凝胶相对浊度的变化。以初始散射光强为参照标准，设相对浊度初始值为100%。

1.2.5MTT法细胞毒性实验

细胞毒性通过常规的MTT法测定，采用人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)评价PVCL纳米凝胶的生物相容性。HK-2细胞用DMEM培养液在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每3 d更换一次培养液。细胞株以每孔1×104个细胞的密度接种到96孔培养板上，在含有5% CO2的湿润空气氛围下培养24 h后，弃培养液，并用新鲜磷酸盐缓冲溶液洗涤2次，再分别加入新鲜的一定浓度的P(VCL-MBA-MAA)或P(VCL-BAC-MAA)。平行操作3份。48 h后，吸出孔内的上清液，用新鲜磷酸盐缓冲溶液洗涤后在每孔中加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，37 ℃下继续培养4 h。弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光振荡10 min，使结晶物充分溶解。使用自动酶标仪检测490 nm处吸光度(OD490)。按下式计算细胞抑制率：

2结果与讨论

2.1PVCL纳米凝胶的粒径(表1)

从表1可以看出，(1)交联剂不同，得到的PVCL纳米凝胶的粒径也不同。如P(VCL-MBA4-MAA0)的粒径(430 nm)远大于P(VCL-BAC4-MAA0)的粒径(212 nm)。这是因为，相比于BAC，MBA的亲水性较好，因此与亲水性的VCL更容易发生共聚，从而使开始形成的初始粒子更容易继续共聚剩余的单体和寡聚物，形成较大的粒子。(2)随着交联剂MBA用量的增加，粒径随之增大。这是因为，MBA用量增加，致使VCL转化率提高，聚合反应的单体总转化率也提高，PVCL纳米凝胶的粒径相应增大[5]。(3)在BAC用量一定时，PVCL纳米凝胶的粒径随MAA用量的增加逐渐增大，且具有较窄的粒径分布(PI<0.1)。这是因为，随着MAA用量的增加，PVCL纳米凝胶中亲水的PMAA链增多，亲水性增强，更易膨胀，粒径相应增大[11]。

表1PVCL纳米凝胶的粒径

注：MBA、MAA、BAC后的数字分别表示MBA、MAA、BAC相对于单体(VCL+MAA)的质量分数，%；D为在pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中测得的粒径；PI为粒径的分散系数。

2.2红外光谱分析(图2)

由图2可知，3种PVCL纳米凝胶红外光谱中，2 927～2 856 cm-1处均出现了-CH2的伸缩振动峰[12]，1 630 cm-1和1 481～1 439 cm-1处均出现了PVCL的酰胺C=O和C-N的特征峰[13]；在P(VCL-BAC4-MAA4)的红外光谱中，1 726 cm-1处出现了明显的肩峰，对应于PMAA中羰基的伸缩振动[13]。表明通过共聚MAA成功地将PMAA引入聚合物网络中。

2.3拉曼光谱分析(图3)

由图3可知，在P(VCL-BAC4-MAA0)的拉曼光谱中，可清楚地看到510 cm-1处出现了二硫键(-S-S-)的特征吸收峰[14]，而P(VCL-MBA4-MAA0)的拉曼光谱中却没有出现。表明二硫键通过共聚交联剂BAC已成功地引入聚合物网络。

2.4透射电镜分析(图4)

由图4可看出，纳米凝胶P(VCL-BAC4-MAA0)和P(VCL-MBA4-MAA0)均呈均匀、规则的球状形貌，并且前者的粒径小于后者。表明交联剂对PVCL纳米凝胶的粒径影响显著，与表1结果相符。

BAC用量一定、MAA用量不同的PVCL纳米凝胶的TEM照片如图5所示。

由图5可看出，所有纳米凝胶粒子均呈均匀、规则的球状形貌，粒径随着MAA质量分数的增加而增大，与PVCL纳米凝胶的粒径变化规律相符。

2.5PVCL纳米凝胶的环境响应性

2.5.1温度响应性

(1)温度对PVCL纳米凝胶粒径的影响(图6)

由图6可知，2种PVCL纳米凝胶均表现出明显的温度响应性，即随着温度的升高，PVCL纳米凝胶变得疏水且开始收缩，表现为粒径减小；MBA交联的纳米凝胶的VPTT(32.2 ℃)高于BAC交联的纳米凝胶

(30.3 ℃)。这是因为，MBA亲水性较好，增强了粒子与水分子之间的相互作用，从而一定程度上限制了疏水性聚合物网络的收缩。

(2)MAA用量对PVCL纳米凝胶VPTT的影响(表2)

表2MAA用量对PVCL纳米凝胶VPTT的影响

Tab.2 Effect of MAA dosage on VPTT of PVCL nanogels

由表2可知，随着MAA用量的增加，BAC交联的PVCL纳米凝胶的VPTT逐渐升高。这是因为，随着MAA用量的增加，聚合物链的亲水性和静电排斥作用均增强，破坏聚合物链之间亲疏水作用的平衡需要较高的温度，从而导致VPTT升高[15]。

2.5.2pH值响应性

(1)MAA用量对PVCL纳米凝胶Zeta电势的影响(表3)

表3MAA用量对PVCL纳米凝胶Zeta电势的影响

Tab.3Effect of MAA dosage on Zeta potential of PVCL nanogels

注：Zeta电势在25 ℃、不同pH值的磷酸盐缓冲溶液中测得。

PVCL纳米凝胶由于共聚了亲水性单体MAA，使其表面带有羧基，因此表现出明显的pH值响应性。由表3可知，PVCL纳米凝胶的Zeta电势与pH值和MAA用量有关。pH值越大、MAA用量越多，PVCL纳米凝胶表面的负电荷就越多，Zeta电势相应越低。

(2)pH值对PVCL纳米凝胶粒径和Zeta电势的影响(图7)

由图7可知，P(VCL-BAC4-MAA3)的粒径随pH值的增大而增大，Zeta电势随pH值的增大而降低。这是因为，pH值的增大使粒子表面的负电荷增多，羧基之间的静电排斥作用增强，粒子发生膨胀，因此粒径增大。

2.5.3温度/pH值耦合响应性

由表2可知，PVCL纳米凝胶还具有温度/pH值耦合响应性，VPTT随着pH值的增大和MAA含量的增加而升高。对于P(VCL-BAC4-MAA3)纳米凝胶，当pH值从5.5增大至7.4时，VPTT从28.5 ℃升高到47.5 ℃。pH值较大时，聚合物中的PMAA离子化程度高，使聚合物链之间静电排斥作用增强，导致较高的VPTT，这与凝胶粒子在相应条件下电势的变化相符(表3)。pH值较小时，羧基电离程度减弱，凝胶粒子表面负电荷减少，静电排斥作用减弱，导致VPTT向低温方向移动。如，在pH=5.5的酸性环境中，PMAA电离程度减弱，使聚合物链之间的静电排斥作用减弱，降低了粒子的稳定性[16]，造成MAA相对于单体质量分数小于3%的凝胶粒子在温度达到VPTT之前就发生聚集，因此无法得到准确的VPTT值。

2.6PVCL纳米凝胶的还原降解性

P(VCL-MBA4-MAA0)和P(VCL-BAC4-MAA0)在不同pH值、10 mmol·L-1DTT中的相对浊度随时间的变化如图8所示。

由图8可知，P(VCL-MBA4-MAA0)在不同pH值环境中均很稳定，在24 h内相对浊度几乎未发生变化；P(VCL-BAC4-MAA0)在不同pH值条件下的相对浊度均发生了不同程度的降低，表明粒子发生了降解。如，在pH=8.3和pH=7.4条件下，P(VCL-BAC4-MAA0)纳米凝胶在30 min内几乎完全降解；在pH=6.5条件下，150 min内相对浊度降低近50%。表明，还原剂DTT使粒子内部的二硫键发生断裂而还原成巯基，粒子发生降解。由于DTT在高pH值条件下的还原能力较强，因此粒子降解的速度较快。

2.7PVCL纳米凝胶的细胞毒性(图9)

由图9可知，在1～500 μg·mL-1浓度范围内，两种PVCL纳米凝胶对HK-2细胞的生长均未产生明显的抑制作用，即使在浓度高达100 μg·mL-1时，细胞的存活率仍然接近100%，这与PVCL纳米凝胶具有良好的生物相容性有关。表明，PVCL纳米凝胶的细胞毒性小、生物相容性好，非常适合用作药物载体。

3结论

以N-乙烯基己内酰胺(VCL)为主单体、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)或N,N′-双(丙烯酰)胱胺(BAC)为交联剂、甲基丙烯酸(MAA)为亲水性共聚单体，采用水相沉淀聚合法制备了刺激响应性PVCL纳米凝胶，研究了交联剂及MAA对PVCL纳米凝胶性能的影响。红外光谱和拉曼光谱表明，所制备的PVCL纳米凝胶符合分子设计，电镜下呈规则、均匀的球形；随着交联剂亲水性和用量的增加、MAA用量的增加，制得的PVCL纳米凝胶的粒径增大；制备的PVCL纳米凝胶粒子具有温度/pH值响应性，MBA为交联剂的PVCL纳米凝胶在还原性介质中很稳定，而BAC为交联剂的PVCL纳米凝胶在还原性介质中由于二硫键发生还原性断裂而降解；制备的PVCL纳米凝胶细胞毒性小、生物相容性好，适合用作药物载体。

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Preparation and Performance of Stimuli-ResponsivePoly(N-vinylcaprolactam) Nanogel

WANG Yang,GU Zhun

(DepartmentofBiologicalandChemicalEngineering,SuzhouChien-ShiungInstituteofTechnology,Taicang215411,China)

Keywords：N-vinylcaprolactam(VCL);waterprecipitationpolymerization;nanogel;reductivedegradation;cytotoxicity

Abstract：UsingN-vinylcaprolactam(VCL)asamainmonomer,stimuli-responsivepoly(N-vinylcaprolactam)(PVCL)nanogelswerepreparedbyawaterprecipitationpolymerizationmethod.Theeffectsofcross-linker(MBAorBAC)andhydrophiliccomonomer(MAA)ontheperformanceofPVCLnanogelswereinvestigatedbyDLS,FTIR,RamanandTEM.ResultsindicatedthattheparticlesizeofPVCLnanogelsincreasedwithincreasingofthehydrophilicityofcross-linkerandthedosageofcross-linkerandcomonomerMAA.ThePVCLnanogelshadtemperatureandpHvalueresponsiveness,andtheycouldbedegradedinareductiveenvironment.ResultsofcytotoxicityexperimentindicatedthatPVCLnanogelspossessedlowcytotoxicityandexcellentbiocompatibility,thustheyweresuitableforusingasdrugcarriers.

基金项目：太仓市科技计划应用基础项目(TC2014YY02)，苏州市生物医药绿色合成重点实验室项目(SZSD201402)

收稿日期：2016-01-22

作者简介：王杨(1979-)，女，江苏连云港人，博士，讲师，研究方向：医用高分子材料，E-mail：wangyang_423@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.06.008

中图分类号：O 632.7

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)06-0039-06

化学与生物工程2016年6期

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