抗α烯醇化酶抗体在自身免疫性甲状腺炎中的表达

张红梅，秦娟，项阳，李静，单忠艳，滕卫平

（中国医科大学附属第一医院内分泌科，中国医科大学内分泌研究所，辽宁省内分泌疾病重点实验室，沈阳　110001）



抗α烯醇化酶抗体在自身免疫性甲状腺炎中的表达

张红梅，秦娟，项阳，李静，单忠艳，滕卫平

（中国医科大学附属第一医院内分泌科，中国医科大学内分泌研究所，辽宁省内分泌疾病重点实验室，沈阳110001）

摘要目的对自身免疫性甲状腺炎（AIT）患者外周血抗α-烯醇化酶抗体（ENO1Ab）表达及其与抗甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）、抗甲状腺球蛋白抗体（TgAb）产生和甲状腺功能（甲功）变化的相关性进行分析。方法ELISA检测患者抗ENO1总IgG及4种亚型滴度。罗氏E601检测患者甲功和TPOAb、TgAb。结果与非AIT患者相比，无论是甲功正常还是减退的AIT患者，其血清抗ENO1总IgG和IgG1、IgG2、IgG3亚型的滴度均显著升高，而IgG4水平无统计学差异。在AIT患者中，血清抗ENO1 总IgG和4种亚型的滴度均未显示与血清游离甲状腺素（FT4）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、促甲状腺素（TSH）、TPOAb、TgAb水平有明显相关，并且甲减组与甲功正常组相比，其滴度及血TPOAb、TgAb水平也无统计学差异。结论在甲状腺自身免疫反应中ENO1Ab的产生显著增加，但可能不是影响甲功的主要抗体。

关键词α烯醇化酶；自身抗体；自身免疫；甲状腺炎

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自身免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）除可致甲状腺破坏外，还可引起其他组织器官受累，其中AIT相关脑损害正逐渐受到多学科关注。α-烯醇化酶（α-eno1ase，ENO1）可作为自身抗原诱发免疫炎性反应［1］。国外已有研究［2-3］报道了抗

ENO1抗体（ENO1 antibody，ENO1Ab）在AIT病患者外周血中阳性检出率较高（44%～83%）。因此，本研究主要针对AIT患者外周血ENO1Ab滴度与抗甲状腺过氧化物酶抗体（anti-thyroperoxidase antibody，TPOAb）和抗甲状腺球蛋白抗体（anti-thyrog1obu1in antibody，TgAb）的产生以及甲状腺功能（简称甲功）的变化的相关性进行分析。

1　材料与方法

1.1研究对象

随机选取2013年5月至2015年3月我院门诊和病房新诊断的AIT患者44例。其中，甲功正常组22例，甲功减退组（甲减）22例；男2例、女42例；平

均年龄（42.09±14.52）岁。另选取没有AIT并且甲功正常者36例（非AIT组），男8例，女28例；平均年龄（41.03±13.71）岁。所有入选者均否认脑血管疾病、风湿免疫病、恶性肿瘤和近期感染病史。AIT诊断标准［4］：血清TPOAb或TgAb升高，并且甲状腺超声显示为弥漫性低回声，可伴有网格状改变或分布不均匀。非AIT患者主要来自于年龄匹配、为筛查有无甲状腺结节或甲功异常而就诊者，根据其甲功、TPOAb、TgAb测定以及甲状腺超声检查结果确定为无AIT且甲功正常者。

1.2方法

1.2.1血ENO1Ab检测：以重组ENO1蛋白（北京义翘神州生物技术有限公司，1 μg/孔）作为包被抗原，利用pH 9.6，0.05 mo1/L碳酸盐缓冲液作为包被液，间接ELISA法检测外周血抗ENO1总IgG和4种亚型滴度［5］。为测总IgG，血清1∶50稀释；为测IgG1亚型，血清1∶200稀释，IgG2亚型1∶15，IgG3亚型1∶15，IgG4亚型1∶5稀释。辣根过氧化物酶标记山羊抗人总IgG以及IgG1、IgG2、IgG3、IgG4二抗（北京博奥森公司）的稀释度均为1∶10 000。

1.2.2甲功检测：利用罗氏E601全自动电化学发光免疫分析仪检测血清甲状腺功能（包括TSH、FT3、FT4、TPOAb、TgAb）。

1.3统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行Mann Whitney U检验分析比较组间差异，采用Spearman相关分析进行相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1AIT与非AIT患者中血总IG和4种亚型滴度分析

与非AIT患者相比，无论是甲功正常还是已出现甲减的AIT患者，其血清中ENO1总IgG和其IgG1、IgG2、IgG3亚型的滴度均显著升高，而IgG4亚型无明显差异（图1、2）。

2.2甲减组与甲功正常组血总IG和4种亚型差异及2组ENO1Ab阳性率分析

图1　AIT患者血清抗ENO1总IgG滴度分析Fig.1 Serum level of total IgG against ENO1 in AIT patients with euthyroidism and hypothyroidism

在AIT患者中，甲减组与甲功正常组相比，抗ENO1总IgG和4种亚型的滴度以及血TPOAb、TgAb水平均无统计学差异。以非AIT组抗ENO1总IgG测定结果建立正常参考范围，分析2组AIT患者中ENO1Ab阳性率。AIT甲减组和甲功正常组相比，血ENO1Ab阳性率（100%vs 95.5%）也无统计学差异。

2.3血清总IG及4种亚型与甲功和抗体的相关性

在全部AIT患者中，血清抗ENO1总IgG和4种亚型的滴度均未显示与血游离甲状腺素（free thyroxine，FT4）、游离三碘甲状腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）促甲状腺激素（thyroid stimu1ating hormone，TSH）、TPOAb、TgAb水平有明显相关性，见表1。

3　讨论

ENO1Ab在多种自身免疫疾病中可被检测到［6］。特别是抗ENO1氨基端自身抗体在桥本脑病患者中阳性率显著高于正常对照［7-8］。本研究较系统地分析了AIT患者中ENO1Ab表达及其与甲状腺特异自身抗体和甲功的相关性。结果发现AIT患者血清ENO1Ab水平明显升高，为IgG1、IgG2、IgG3亚型显著增加；但血FT4、FT3、TSH水平与血抗ENO1总IgG及其亚型均无显著相关；血清甲状腺特异抗体TPOAb、TgAb也未显示与ENO1Ab滴度明显相关。提示在AIT这种经典器官自身免疫病中也有ENO1Ab这种非甲状腺特异自身抗体产生；其影响可能不是以对甲状腺细胞的损害为主。

图2　AIT患者中血清中抗ENO1抗体IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型滴度分析Fig.2 Serum levels of IgG1，IgG2，IgG3 and IgG4 subtypes against ENO1 in AIT patients

表1　AIT患者血清ENO1Ab滴度与TPOAb、TGAb及甲功的相关性分析（r）Tab.1 Analysis of the correlations between serum ENO1Ab level and TPOAb，TGAb，as well as thyroid function（r）

既往研究［6］已发现，ENO1Ab在器官特异和非器官特异性自身免疫病中有较高水平表达，包括类风湿（6%～66%）、狼疮（19%～80%）、系统性硬化症（15%～30%）等。本研究又发现AIT患者中该抗体阳性率高达94.5%～100%。ENO1在原核及真核生物中均广泛表达，例如幽门螺旋杆菌［2］和牙周炎致病菌牙龈卟啉单胞菌［3］等微生物中，由于这些微生物与人体ENO1蛋白在氨基酸序列上有高度一致性（51.4%～82%），其感染可能导致自身耐受被打破，而诱发针对人体ENO1的交叉自身免疫反应，导致ENO1Ab产生，并进一步引起细胞受损［9］。国外学者利用牙龈卟啉单胞菌ENO1蛋白进行免疫，小鼠体内产生抗环瓜氨酸ENO1抗体，并最终发生关节炎［3］。提示微生物感染确实可能打破人类机体对ENO1免疫耐受，诱发自身免疫反应。而对类风湿患者的研究显示，从交叉自身免疫反应发生至临床起病可能需要数年之久。但是如果针对ENO1蛋白的交叉反应均是这些自身免疫病的启动因素，那么其在不同个体中启动不同种自身免疫病的机制尚不清楚，是否受到某些自身免疫易感基因的调控还有待于进一步研究。此外，在各种已发生的自身免疫炎症反应中，caspase-1通常被激活。研究发现，ENO1蛋白可作为caspase-1底物而被分解为多肽，这些多肽如在局部未被有效清除，则可作为自身抗原而诱导自身免疫反应和ENO1Ab产生。最新研究还发现，凋亡细胞表面SUPER蛋白是参与凋亡细胞被免疫细胞识别和处理的关键因素，该蛋白是指在活细胞中正常存在、在进化上高度保守、对蛋白酶敏感、普遍广泛表达且暴露于细胞表面的蛋白。ENO1是凋亡细胞表面最丰富的酶，被认为是最典型SUPER蛋白，可作为自身抗原诱导针对原发病所致凋亡细胞的自身免疫反应，同时产生ENOAb1。而且单核和巨噬细胞在免疫炎症状态下被激活，IFN-γ等因子可刺激其ENO1从细胞质向细胞膜转移增多，膜上过度表达ENO1也可诱导机体产生抗ENO1抗体［10］。目前笔者正在分别利用Tg和ENO1重组蛋白进行动物免疫，探讨在AIT中ENO1Ab产生的具体机制。

由于ENO1在血管内皮、神经元等组织细胞内广泛表达，针对ENO1的自身免疫反应可能是参与引起AIT患者甲状腺外病变的重要机制，如桥本脑病和流产、肾小球肾炎［1，7-8，11-12］。研究发现，ENO1Ab可通过识别ENO1的膜联形式和/或干扰它的功能而诱发免疫炎性反应，导致组织损伤。在狼疮肾炎患者的肾小球中表达最多的是抗ENO1和膜联蛋白A1 IgG2型自身抗体［13］。ENO1被认为是大脑中主要纤溶酶原受体。纤溶酶原与ENO1结合后刺激纤溶酶活化，可促进降解淀粉样蛋白β，具有神经保护作用［14-15］。日本学者初步研究［7-8］已发现桥本脑病患者中血ENO1Ab阳性率高44%～83.3%，而本研究也发现AIT患者血ENO1Ab显著升高，但还需进一步确定ENO1Ab是否为导致脑功能异常的直接病因，其潜在病理意义和产生机制还有待研究。

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（编辑于溪）

Expressionof Alpha-enolase Specific Autoantibodyinthe Patientswith Autoimmune Thyroiditis

ZHANGHongmei，QINJuan，XIANGYang，LIJing，HANZhongyan，TENGWeiping
（Department of Endocrino1ogy and Metabo1ism，Institute of Endocrino1ogy，The First Hospita1，China Medica1 University，Liaoning Provincia1 Key Laboratory of Endocrine Diseases，Shenyang110001，China）

AbstractObjective Toinvestigatetheexpressionofanti-ENO1autoantibody（ENO1Ab）inpatientswithautoimmunethyroiditis（AIT）andexp1ore its corre1ation with thyroid functions and the production of c1assica1 thyroid-specific autoantibodies，inc1uding anti-thyroperoxidase antibody （TPOAb）and anti-thyrog1obu1in antibody（TgAb）. Methods Serum 1eve1s of ENO1-specific tota1 IgG and four subc1asses were determined by ELISA using recombinant ENO1 protein as coat antigen. Serum FT4，FT3，TSH，TPOAb and TgAb were measured on Roche E601. Results As compared with the contro1s，serum 1eve1s of ENO1-specific tota1 IgG，IgG1，IgG2 and IgG3 werea11significant1y increased in both AIT patients with euthyroidism and hypothyroidism. Among a11 the AIT patients，neither serum titer ofENO1-specific tota1 IgG nor the four isotypes were significant1y corre1ated with that of FT4，FT3，TSH，TPOAb or TgAb. There were no significant differences in serum titers of ENO1-specific tota1 IgG between AITpatientswitheuthyroidismandhypothyroidism，aswe11asthe TPOAband TgAb.Conclusion Theproductionof ENO1Abcanbeobvious1yinducedinthyroidautoimmuneresponses；however，itmaynotbethemainpathogenicfactortoaffectthyroideconomy.

Keywordsα-eno1ase；autoantibody；autoimmunity；thyroiditis

中图分类号R581.4

文献标志码A

文章编号0258-4646（2016）06-0499-04

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.005

基金项目：国家自然科学基金（81273296；30972740）、辽宁省教育厅第四批辽宁特聘教授人才项目（2014-187）

作者简介：张红梅（1985 -），女，技师，本科.

通信作者：李静，E-mai1：1ijingendocrine@126.com

收稿日期：2015-12-25