LY294002联合姜黄素对人肾癌细胞的体外抑制作用

张震，王学梅，徐克

（中国医科大学附属第一医院1.超声科；2.放射介入科，沈阳110001）



LY294002联合姜黄素对人肾癌细胞的体外抑制作用

张震1，王学梅1，徐克2

（中国医科大学附属第一医院1.超声科；2.放射介入科，沈阳110001）

摘要目的研究磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）特异性抑制剂LY294002与姜黄素联合对人肾癌细胞的抑制作用。方法应用CCK-8法检测姜黄素单独或联合LY294002对人肾癌细胞786-O的抑制率；TUNEL及免疫荧光法检测caspase-3，观察姜黄素单独或联合LY294002对786-O细胞凋亡的影响。结果LY294002联合姜黄素能显著增加姜黄素对786-O细胞的抑制率，同时显著增强姜黄素对细胞凋亡的诱导作用（P＜0.05）。结论PI3K特异性抑制剂LY294002通过促进786-O细胞凋亡提高其对姜黄素的敏感性，抑制PI3K/Akt信号转导通路的活性能够提高姜黄素的肿瘤杀伤作用。

关键词磷脂酰肌醇-3激酶；抑制剂LY294002；姜黄素

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磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidy1inosito1 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号传导通路是肿瘤细胞生存的最重要通路，与肿瘤细胞的生存、增殖、转移、蛋白合成以及放化疗的耐受密切相关，在肾癌的发生和发展中也发挥重要作用。近年研究发现，PI3K抑制剂LY294002能够增强抗肿瘤药物的敏感性和疗效，部分逆转化疗的耐药性［1-3］，但仅少量文献报道涉及了肾癌。姜黄素是一种具有很强还原作用的试剂，能够增强多种化疗药物的抗癌活性和对肿瘤细胞的杀伤作用，但是LY294002联合姜黄素对人肾癌细胞的作用尚未见报道。本研究通过探讨LY294002联合姜黄素对人肾癌细胞增殖抑制的影响，进一步探究其可能的作用机制，为治疗提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞培养：786-O细胞系在含10%胎牛血清、1%青/链霉素的RPMI 1640培养基中培养，37℃、95%湿度、5%CO2孵箱中孵育。长到对数生长期时用于研究。

1.1.2实验分组：分为4组，即对照组、姜黄素单独用药组（10、20和40 μmo1/L姜黄素）、LY294002单独用药组（20 nmo1/L LY294002）、联合用药组（10、20 和40 μmo1/L姜黄素+20 nmo1/L LY294002）。

1.2方法

1.2.1CCK-8法检测786-O细胞抑制率：取对数生长期的786-O细胞，向96孔板各孔中加入100 μL细胞悬液，保证每孔的细胞数为5×103个。将细胞放于37℃、5%CO2培养箱内培养，待细胞贴壁后按照分组进行处理。共同孵育时间为24和48 h。弃掉原有培养液，向每孔加100 μL的培养液及10 μL CCK-8，继续培养3 h后用酶标仪检测OD490处各孔吸光度（absorbance，A）。计算各组细胞增殖抑制率（%）= （1-A实验组/A对照组）×100。

1.2.2TUNEL染色：TUNEL试剂盒用于细胞凋亡检测。各组处理后的786-O细胞染色依据试剂盒说明书中的步骤进行，肿瘤细胞用罗丹明染色，2 h后洗脱并计数。凋亡细胞计数和分析，使用日本O1ympus IX71-A12FL/PH倒置显微镜照相。

1.2.3免疫荧光染色：使用直接免疫荧光法检测caspase-3和PI3K-p110γ蛋白表达。786-O细胞根据分组加入LY294002和姜黄素进行单独或联合处理，与caspase-3和PI3K-p110γ抗体（1∶100）室温孵育40 min，避光，使用1 μmo1/L DAPI染核。阳性染色细胞照相使用O1ympus IX71-A12FL/PH倒置荧光显微镜。

1.3统计学分析

所有数据采用x±s表示，使用SPSS 19.0软件进行统计学t检验和单因素方差分析。所有实验均独立重复3次，每组6个复孔。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1姜黄素和LY294002对肿瘤细胞的细胞毒性作用

姜黄素单独用药组、LY294002单独用药组和联合用药组与对照组比较，786-O细胞的生长率显著受到抑制，各组A值均有下降，且肿瘤细胞的活性随着姜黄素浓度增加而降低，呈剂量依赖性（P＜0.05）。联合用药组肿瘤细胞的活性较单独用药组下降幅度稍大，表明二者联合的细胞毒性大于单独应用姜黄素。见表1。

2.2姜黄素下调PI3K-p110γ的表达

应用LY294002（20 nmo1/L）完全抑制PI3K-p110γ的表达。应用不同浓度姜黄素作用后，随着姜黄素浓度的增加，PI3K-p110γ的表达显著下降（P＜0.05）。提示姜黄素对抗肿瘤的作用可能与PI3K/ Akt信号转导通路的活性有关。见图1。

2.3姜黄素和LY294002诱导肿瘤细胞凋亡

TUNEL染色结果显示，姜黄素单独用药组或联合用药组均能诱导786-O细胞凋亡，且随着姜黄素的浓度增加呈增强趋势；联合用药组与姜黄素单独用药组比较，凋亡细胞数的差异有统计学意义（P＜0.05）。免疫荧光染色显示，786-O细胞内的凋亡相关蛋白caspase-3表达也显著上调（P＜0.05），且随着浓度的增加表达呈增强趋势；联合用药组与姜黄素单独用药组比较，凋亡细胞数的差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。这些结果表明，LY294002有增强姜黄素诱导细胞凋亡的作用。

表1　LY294002和姜黄素对786⁃O细胞的抑制作用（%）Tab.1 Inhibitory rate of LY294002 and curcumin to 786⁃O cells （%）

3　讨论

姜黄素是从姜黄根茎中提取出的一类黄色酚类物质，是姜黄的主要有效成分之一，方便易得。姜黄素具有抗肿瘤作用，可以通过多种机制诱导肿瘤细胞凋亡，如抑制细胞内脂肪酸合酶［1］、通过诱导活性氧簇产生细胞遗传毒性效应［2］。miR-21介导姜黄素增殖、凋亡、转移、抗癌耐药性等多种效应，可结合于miR-21的启动子，通过PTEN/PI3K/Akt传导通路和核因子κB基因传导通路下调miR-21的表达来实现［3］。

PI3K信号参与增殖、分化、凋亡等多种细胞功能的调节。PI3K是由催化亚单位p110和调节亚单位p85组成的二聚体蛋白，具有类脂激酶和蛋白激酶的双重活性。PI3K可通过Ras和p110直接结合导致PI3K的活化。研究发现，敲除PI3K-p110γ能够通过引起肿瘤细胞在G0～G1期细胞周期停滞抑制细胞增殖［4］。PI3K及其下游分子蛋白激酶B（PKB或Akt）组成的信号通路与人类肿瘤的发生发展密切相关。在肿瘤切除术后，PI3K能够通过抑制凋亡和产生并诱导对化疗药物的耐药性加速肿瘤生长［5］。

联合LY294002抑制PI3K信号通路后，姜黄素

图1　不同浓度姜黄素对PI3K⁃p110γ表达的影响Fig.1 Effects of curcumin at different concentrations on the expressions of PI3K⁃p110γ

图2　TUNEL染色和caspase⁃3免疫荧光染色检测786⁃O细胞凋亡Fig.2 Apoptosis of 786⁃O studied by TUNEL staining and immunofluorescence of caspase⁃3

显著抑制结肠癌细胞系的增殖、转移、侵袭和克隆形成，并上调caspase-3的表达，具有剂量依赖性［6］。在前列腺癌中，随姜黄素药物浓度增加，姜黄素上调p53和第15位丝氨酸磷酸化的表达，明显活化caspase-3诱导的细胞凋亡［7］，与我们在786-O细胞系中观察到的结果一致。

本研究中，姜黄素与PI3K抑制剂LY294002联合作用效果显著强于姜黄素单独作用，LY294002能够增强姜黄素的细胞毒性作用，增强对786-O细胞凋亡的诱导作用，强化凋亡相关蛋白caspase-3的表达。综上所述，姜黄素可能通过抑制PI3K/Akt相关通路的活化来产生诱导786-O细胞凋亡的作用。

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（编辑陈姜）

Inhibitory Effectof LY294002 Combinedwith Curcuminoninvitro Cultured Renal Carcinoma Cells

ZHANGZhen1，WANGXuemei1，XUKe2
（1. Department of U1trasound，The First Hospita1，China Medica1 University，Shenyang 110001，China；2. Department of Radio1ogy and Intervention，The First Hospita1，China Medica1 University，Shenyang110001，China）

AbstractObjective To investigate the inhibitory effect of phosphatidy1cho1ine-3 kinase（PI3K）specific inhibitor，LY294002，combined with curcumin onin vitro cu1tured rena1 carcinoma ce11s. Methods Rena1 carcinoma ce11s were treatedwith PI3K specific inhibitor LY294002，curcumin a1one，or in combination. CCK-8 assay was used to measure the inhibitory rate. TUNEL staining and immunof1uorescence of caspase-3 were app1iedtoeva1uatetheapoptoticeffects.Results Inhibitoryrateof786-Oce11swassignificant1yincreasedunderthecombinationadministrationofcurcumin and LY294002，and the apoptosis were significant1y induced（P＜0.05）. Conclusion Sensitivity to curcumin of 786-O cou1d be increased by LY294002throughtheapoptosis-re1atedmechanisms，and inhibition of PI3K/Aktpathwaymightbere1atedwiththeactivationofanti-tumoreffect bycurcumin.

Keywordsphosphatidy1cho1ine-3 kinase；inhibitor LY294002；curcumin

中图分类号R34

文献标志码A

文章编号0258-4646（2016）06-0491-04

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.003

基金项目：国家自然科学基金（81600020，81471809）；辽宁省科学技术计划（2013225049）

作者简介：张震（1975 -），女，副教授，博士.

通信作者：徐克，E-mai1：wangzy@mai1.cmu.edu.cn

收稿日期：2016-03-21