趋化因子CXCL17在胃癌组织中的表达及其临床相关性研究*

余进龙，　阮静瑶，　李松翰，　何邦杰，　朱娉逸，　薛向阳，　邹阮敏，　林刻智

(温州医科大学1第一临床医学院，2微生物与免疫学教研室，3附属第一医院妇产科，4基础医学中心，浙江 温州 325035)



趋化因子CXCL17在胃癌组织中的表达及其临床相关性研究*

余进龙1，阮静瑶1，李松翰1，何邦杰1，朱娉逸1，薛向阳2，邹阮敏3△，林刻智4△

(温州医科大学1第一临床医学院，2微生物与免疫学教研室，3附属第一医院妇产科，4基础医学中心，浙江 温州 325035)

[摘要]目的： 分析趋化因子CXCL17在胃癌及癌旁正常组织的表达及分布情况，并探讨其差异表达的临床意义。方法: 分别采用实时荧光定量PCR和免疫组化对40例术后切除的胃癌及相应癌旁正常胃组织CXCL17的表达及分布情况进行检测。通过临床病理分析及Kaplan-Meier生存曲线的分析，明确CXCL17在胃癌组织中的表达情况及其临床意义。结果: CXCL17蛋白和mRNA的表达在胃癌组织较癌旁正常组织明显降低(P<0.05)。临床病理数据分析显示，CXCL17表达的下调与胃癌分化程度有关(P<0.01)，与病人性别、年龄、淋巴结转移、原发部位肿瘤大小、肿瘤分期、癌胚抗原表达水平等未见明显相关性。Kaplan-Meier生存分析显示，CXCL17高表达组相对低表达组有明显的生存延长(P<0.05)。结论: CXCL17可作为胃癌预后的关键因素之一参与胃癌的发生发展。

[关键词]胃癌； 趋化因子CXCL17； 生存分析

胃癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一。尤其在我国胃癌死亡率是欧美发达国家的4～8倍，近30年来胃癌的发病率及死亡率一直位居恶性肿瘤的前三位，是危害我国人民身体健康的重大疾病[1-2]。目前的研究显示，肿瘤微环境在胃癌形成过程中发挥了重要的作用，特别是局部低氧、酸性微环境和间质高压等特性均十分有利于肿瘤的增殖、侵袭和恶性转化[3]。肿瘤微环境主要包括基质细胞、免疫细胞、细胞因子、肿瘤细胞、趋化因子及其受体等，其中趋化因子的表达水平改变，可影响局部的抗肿瘤免疫反应以至于肿瘤治疗的转归[4]。

CXCL17又名血管内皮生长因子共调节趋化因子1[vascular endothelial growth factor (VEGF) co-regulated chemokine 1，VCC-1]，最初于2006年发现，在正常人体的呼吸、消化以及部分泌尿生殖系统有不同程度的表达[5-6]，具有募集免疫细胞、抗炎、抗菌、促进血管生成等多种生物学功能[6-7]，其中促进血管生成的活性与肿瘤血管生成密切相关，引起了研究人员的关注。目前，CXCL17与肝癌、胰腺癌、乳腺癌和结肠癌等部分肿瘤的关系已经有相关报道，而在胃癌组织中的表达水平及临床意义未见相关报道。本课题组在研究趋化因子CXCL14与胃癌的关系时[8]，意外地发现趋化因子CXCL17在基因表达谱中呈下调趋势，这使我们猜测其是否可能与胃癌的发展相关？为探讨CXCL17与胃癌的关系，本研究主要通过免疫组化、实时荧光定量PCR等技术并结合临床病理数据分析以及生存分析，明确CXCL17在胃癌组织中蛋白和mRNA的表达水平及其临床意义。

材料和方法

1主要试剂

TRIzol试剂购自Invitrogen；ReverTra Ace逆转录试剂盒和SYBR Master Mix荧光定量PCR试剂盒购自Toyobo；小鼠抗人CXCL17蛋白Ⅰ抗购自R&D；HRP标记羊抗小鼠Ⅱ抗、羊血清和DAB显色剂购自北京中杉金桥生物公司；引物由华大基因科技股份有限公司合成。

2组织标本采集及处理

40例胃癌及相应癌旁正常组织均取自温州医科大学附属第一医院的胃癌术后标本。胃癌的病理学诊断由医院病理科术后根据WHO的标准证实。所有患者术前未接受放疗或化疗，且在术后根据NCCN胃癌指南接受严格化疗。以上胃癌组织及相应癌旁正常组织(取自距癌灶5 cm处)的配对标本(胃癌及其癌旁正常组织)均被分为2个部分：一部分标本在手术切除后30 min内在液氮中保存，以备RNA提取；另一部分标本经4%甲醛固定，石蜡包埋，用于免疫组化检测。

3方法

3.1免疫组化实验5 μm的石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、3% H2O2阻断内源性过氧化氢酶。微波修复，冷却至室温后，羊血清封闭1 h。甩去血清，滴加CXCL17特异性抗体，4 ℃冰箱孵育过夜。次日，室温下复温30 min。参照说明书，滴加羊抗鼠II抗，37 ℃孵育30 min。PBS清洗，甩干。DAB显色。苏木素复染、中性树胶封片。每次实验均以已知免疫组化染色阳性的切片作阳性对照,以PBS代替I抗作阴性对照以确保实验结果可靠性。平均吸光度值由Image-Pro Plus 6.0软件计算所得。

3.2RNA抽提和荧光定量PCR实验总RNA的抽提参照TRIzol试剂说明书，提自液氮保存的胃癌及其相应癌旁正常组织；经异丙醇离心沉淀后置于-20 ℃过夜；次日，去上清，75%乙醇再次离心沉淀并弃上清。将RNA沉淀溶于DEPC水，经紫外分光光度计检测RNA的纯度及浓度，并于-80 ℃储存，用于定量PCR实验。

cDNA第一链由提取自组织的RNA参照ReverTra Ace逆转录试剂盒说明书逆转录而来。反应结束后置于-20 ℃保存。以20 μL反应体系进行real-time PCR。相关引物序列信息见表1。反应体系包括 1 μL逆转录产物、2×SYBR Green I Master Mix、0.5 μmol/L上游引物和0.5 μmol/L下游引物。程序设定为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环40次(StepOnePlusTMReal-Time PCR system)。所有样品均严格按照3个复孔进行实验。根据待测标本的Ct值，以GAPDH为内参照，采用相对定量法，以2-ΔΔCt表示标本中CXCL17相对表达量，其中ΔΔCt=(CtCXCL17-CtGAPDH)肿瘤-(CtCXCL17-CtGAPDH)癌旁。

4统计学处理

应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。对免疫组化结果与各临床病理因素的相关性进行独立样本t检验和卡方检验。用Kaplan-Meier法对CXCL17高表达组与低表达组生存分析进行5年生存率分析，组间差异比较用log-rank检验。所涉及的数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1胃癌组织中CXCL17 mRNA的表达下调

RT-PCR电泳结果显示在255 bp左右的癌旁正常组织电泳结果可见明亮的单一条带，而癌组织在相应位置处的条带微弱或无条带。为了检测CXCL17在胃癌组织中的表达量，我们建立了特异且敏感的实时荧光定量PCR体系，CXCL17与GAPDH的熔解曲线均为单一尖峰，证明我们所建立的体系能够特异地扩增目的基因,用以分析mRNA的相对表达量。2-ΔΔCt法分析显示，肿瘤组织中CXCL17的mRNA表达量相对于癌旁正常组织而言明显降低，仅为癌旁正常组织的0.68,见图1。

Figure 1.The mRNA expression of CXCL17 in human gastric cancer and gastric tissues. N: normal; T: tumor; blank: blank control. Mean±SD.n=40.*P<0.05vsnormal.

图1胃癌及癌旁组织CXCL17的mRNA表达水平

2免疫组化结果表明CXCL17蛋白在胃癌组织中表达下降

免疫组化结果显示在癌旁正常胃组织中，CXCL17主要表达在胃壁组织黏膜部位细胞胞浆中，染色颗粒呈棕褐色强阳性显色。然而，在肿瘤组织中，CXCL17的表达显著降低甚至不表达，免疫组化染色呈淡黄色或不着色。用Image-Pro Plus 6.0半定量分析免疫组化结果，发现CXCL17蛋白在胃癌组织中的表达水平(0.20±0.08)显著低于癌旁正常组织(0.38±0.06)，且两者差异具有统计学显著性(P<0.01),见图2。

Figure 2.The protein expression of CXCL17 in the gastric cancer and normal tissues (immunohistochemical staining, ×400). A: normal (n=40); B: well-differentiated (n=7); C: moderately-differentiated (n=12); D: poorly-differentiated (n=11); E: undifferentiated (n=10). Mean±SD.**P<0.01vsB;##P<0.01vsC.

图2胃癌和癌旁正常组织CXCL17表达水平

3CXCL17蛋白表达水平与胃癌临床病理特征分析

通过对40例肿瘤组织中CXCL17蛋白表达水平与其临床病理特征的相关性分析，结果显示CXCL17与胃癌肿瘤的病理分化类型密切相关，主要表现为肿瘤分化程度越高，CXCL17蛋白表达越高。并且低分化或不分化的肿瘤组织蛋白表达明显低于高分化或中分化组织，高分化胃癌组织染色为深黄色，中分化、低分化组织为淡黄色，低分化组织几乎不表达CXCL17蛋白，表达水平差异显著(P<0.01)。对CXCL17蛋白表达与年龄、性别、淋巴结转移、肿瘤大小和肿瘤分期等的相关性进行分析未见统计学显著性，见表2。

4肿瘤组织中CXCL17表达水平与胃癌预后相关性

根据40例肿瘤组织中CXCL17表达的平均吸光度值数据分布情况，以平均值A=0.251为界限，A低于0.251为CXCL17低表达组(20例)，其余为高表达组(20例)。以Kaplan-Meier法对2组生存情况进行5年生存率分析，并使用log-rank检验对生存曲线的差异进行显著性检验，结果显示不同CXCL17蛋白表达水平的胃癌患者术后总生存之间的差异有统计学显著性 (P<0.05)，高表达组相对低表达组而言有明显的生存延长，表明CXCL17高表达的胃癌患者手术预后情况更优。高、低表达组生存期分别为(26.2±3.8)月和(10.4±3.1)月,见图3。

讨论

CXCL17是趋化因子CXC家族最新发现的一员，是由多种细胞分泌的，能够使不同细胞发生趋化运动的细胞因子，其在肿瘤中的分泌能够影响肿瘤细胞的免疫反应，调节肿瘤细胞的增殖及转移，且与肿瘤血管生成密切相关[4-5]。相关报道指出，在胰腺癌中，随着肿瘤恶性程度的提升，CXCL17的表达反而降低[9],而在肝癌、乳腺癌、结肠癌中，CXCL17表达却上升[10-11]。CXCL17在不同肿瘤组织中呈现的不同表达情况，Weinstein等[5]认为CXCL17能够诱导VEGF等因子表达从而间接促进肿瘤血管生成，加速肿瘤瘤体生长；而Hiraoka等[9]则认为，CXCL17可募集树突状细胞浸润肿瘤组织，介导T细胞的免疫应答，产生抗肿瘤免疫作用。

Figure 3.Survival curves of the gastric cancer patients with different expression levels of CXCL17.

图3胃癌患者CXCL17不同表达水平的生存曲线比较

为研究CXCL17在胃癌中的表达情况，本课题组通过real-time PCR和免疫组化等技术检测胃癌组织及相应的癌旁正常组织中CXCL17的表达水平。免疫组化结果显示，在癌旁正常胃组织中CXCL17蛋白呈棕黄色，且主要表达在黏膜部，这与Burkhardt等[6]的研究结果相符；在胃癌组织中CXCL17的表达较癌旁正常组织有明显下降，并且随着肿瘤恶性度的增高，CXCL17的表达也相应下降，这种表达下调的情况与Hiraoka等[9]在胰腺癌的研究类似。RT-PCR电泳，胃癌癌旁正常组织在255 bp处可见一清晰条带，而胃癌组织中仅隐约可见或无；且实时荧光定量PCR结果显示，在胃癌组织中CXCL17的表达较癌旁正常组织有明显下降。可见，CXCL17在胃癌及癌旁正常胃组织中蛋白与基因表达结果一致。基于Hiraoka等[9]在胰腺癌中的研究，我们推测CXCL17在胃癌中的表达下调，极有可能与肿瘤逃避机体免疫监视并形成肿瘤免疫耐受有关。

通过近5年临床随访资料，进一步进行临床数据统计，结果发现CXCL17在胃癌组织蛋白的表达与肿瘤分化程度具有显著相关性，而与与年龄、性别、淋巴结转移、肿瘤大小和肿瘤分期等无关。生存分析显示肿瘤组织CXCL17蛋白高表达水平患者生存期相对较长，这提示CXCL17可能参与了胃癌发展的过程，且发挥一定的抗肿瘤作用。

综上所述，CXCL17在胃癌中可能扮演了一个抑癌角色，参与胃癌的发生发展。在今后的研究中，我们将进一步探索肿瘤组织中免疫细胞与CXCL17的关系，并深入从基因水平探讨CXCL17在胃癌中下调的具体机制，为胃癌临床治疗及预后提供新靶点，为胃癌的临床药物研发提供新思路。

[参考文献]

[1]邹文斌，李兆申. 中国胃癌发病率及死亡率研究进展[J]. 中国实用内科杂志, 2014, 34(4):408-415.

[2]Archie V, Kauh J, Jones DV Jr, et al. Gastric cancer: standards for the 21st century[J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2006, 57(2):123-131.

[3]曹晓雪，宋光. 胃癌的肿瘤微环境研究进展[J]. 现代生物医学进展, 2014, 14(31):6177-6179.

[4]Strieter RM, Belperio JA, Phillips RJ, et al. CXC chemokines in angiogenesis of cancer[J]. Semin Cancer Biol, 2004, 14(3):195-200.

[5]Weinstein EJ, Head R, Griggs DW, et al. VCC-1, a novel chemokine, promotes tumor growth[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 350(1):74-81.

[6]Burkhardt AM, Tai KP, Flores-Guiterrez JP, et al. CXCL17 is a mucosal chemokine elevated in idiopathic pulmonary fibrosis that exhibits broad antimicrobial activity[J]. J Immunol, 2012, 188(12):6399-6406.

[7]Lee WY, Wang CJ, Lin TY, et al. CXCL17, an orphan chemokine, acts as a novel angiogenic and anti-inflammatory factor[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2013, 304(1):E32-E40.

[8]Lin K, Zou R, Lin F, et al. Expression and effect of CXCL14 in colorectal carcinoma[J]. Mol Med Rep, 2014, 10(3):1561-1568.

[9]Hiraoka N, Yamazaki-Itoh R, Ino Y, et al. CXCL17 and ICAM2 are associated with a potential anti-tumor immune response in early intraepithelial stages of human pancreatic carcinogenesis[J]. Gastroenterology, 2011, 140(1):310-321.

[10]Li L, Yan J, Xu J, et al. CXCL17 expression predicts poor prognosis and correlates with adverse immune infiltration in hepatocellular carcinoma[J]. PLoS One, 2014, 9(10):e110064.

[11]Ohlsson L, Hammarstrom ML, Lindmark G, et al. Ecto-pic expression of the chemokine CXCL17 in colon cancer cells[J]. Br J Cancer, 2016, 114(6):697-703.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Expression of chemokine CXCL17 and its clinical relevance in gastric carcinoma

YU Jin-long1, RUAN Jing-yao1, LI Song-han1, HE Bang-jie1, ZHU Ping-yi1, XUE Xiang-yang2, ZOU Ruan-min3, LIN Ke-zhi4

(1TheFirstClinicalMedicalAcademy,2DepartmentofMicrobiologyandImmunology,3DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstAffiliatedHospital,4MedicalExperimentalTeachingCenter,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China.E-mail:lkz_2013@163.com; 60447697@qq.com)

[KEY WORDS]Gastric cancer; Chemokine CXCL17; Survival analysis

[ABSTRACT]AIM: To investigate the expression and distribution of chemokine CXCL17 in gastric cancer and its clinical significance.METHODS: The CXCL17 expression was detected by real-time PCR and immunohistochemistry. The correlation between the CXCL17 expression and clinicopathological features was statistically analyzed and Kaplan-Meier survival analysis was used to evaluate the prognosis.RESULTS: A lower expression levels of CXCL17 were observed in the tumor tissues compared with the paired normal tissues (P<0.05). Down-regulation of CXCL17 was associated with the degree of tumor differentiation and the size of tumor at primary site (P<0.05). Kaplan-Meier survival analysis showed that increased CXCL17 in the tumor tissues was associated with longer survival time.CONCLUSION: The result might illustrate that CXCL17 acts as a key factor in the prognosis of gastric cancer and is closely associated with the progression of gastric cancer.

[文章编号]1000- 4718(2016)06- 1022- 05

[收稿日期]2015- 12- 18[修回日期] 2016- 03- 23

*[基金项目]浙江省自然科学基金青年项目(No. LQ16H190003)；温州市科技计划项目(No. Y20140216；No. Y20140308)；浙江省大学生科技创新活动计划(新苗人才计划)资助项目(No. 2015R413004)

通讯作者△邹阮敏 Tel: 0577-88069240; E-mail: 60447697@qq.com； 林刻智 Tel: 0577-86689816; E-mail: lkz_2013@163.com

[中图分类号]R730.23

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.010