重组腺病毒介导的猪瘟 E0基因在山羊乳腺中的表达

邵明豪，卓伟伟，贺晓丽，刘　军，权富生，张　涌

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌　712100)

重组腺病毒介导的猪瘟 E0基因在山羊乳腺中的表达

邵明豪，卓伟伟，贺晓丽，刘军，权富生，张涌

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌712100)

摘要为使猪温病毒(CSFV)E0蛋白在奶山羊乳腺中得以合成和分泌，一段上游带有信号肽和His标签序列的CSFV E0基因通过腺病毒穿梭载体被插入到腺病毒质粒中，将此重组质粒转染293A细胞包装得到重组腺病毒Ad-hisE0。为证明其有效性，用Ad-hisE0感染293A细胞，实时定量PCR检测显示 E0基因的表达显著提高。用Ad-hisE0分别感染牛乳腺上皮细胞和泌乳期山羊乳腺，SDS-PAGE和Western blot 分析结果显示出E0蛋白分别位于26 ku和48 ku处的2条特异性条带。证实构建的腺病毒Ad-hisE0可以介导重组融合蛋白CSFV E0在山羊乳腺中的表达和分泌。

关键词CSFV；E0蛋白；腺病毒；乳腺

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的具有高度传染性的传染病，主要感染家猪、野猪和倭猪[1-3]。该病已引起世界范围内养猪业的巨大经济损失。虽然猪瘟病毒在世界上一些地方猪瘟中已被彻底根除，但由于野猪群中仍保留有该病毒，因此，猪瘟被重新引入到家猪群中的威胁依然存在，甚至可能引起猪瘟的新一轮爆发和在世界范围内流行。CSFV的基因组是1条含有一个较大开放阅读框(ORF)的单股正链RNA，长约12.3 kb，编码1个多聚蛋白，最终可加工为12种成熟蛋白[4]。CSFV中可诱导被感染机体产生中和抗体的蛋白为E0和E2，这2个蛋白为猪瘟的2个主要保护性抗原，同时也是病毒吸附敏感细胞而进入细胞的必需蛋白[5]。E0位于CSFV病毒粒子以及被其感染的细胞中，以同源二聚体的形式存在。E0抗原可诱导机体产生针对CSFV的中和抗体，用其免疫猪可诱导机体产生对致死量猪瘟病毒的保护性免疫[6]。此外，与编码E2蛋白的核酸序列相比，编码E0的核酸序列在属内保守度更高，因而E0也是防治猪瘟的一种理想靶蛋白。

目前，许多生物制药学蛋白质并不产生于哺乳动物细胞内，为保证其生物学活性和稳定性，仍需要进一步对其进行翻译后修饰。哺乳动物细胞生物反应器虽然可以保证蛋白在真核细胞内的表达，无需翻译后修饰，但其造价相对较为昂贵。因此，利用泌乳家畜的乳腺大量表达目的重组蛋白的方法被认为是一种更为经济可观的方式[7-9]。利用腺病毒感染反刍动物乳腺，继而在乳汁中获得重组蛋白的方法相对快速、简单，比生产转基因动物更为节省时间[10-12]。因此，本研究构建CSFV E0蛋白的腺病毒表达载体，并用其分别体内以及体外感染乳腺上皮细胞，获得目的重组CSFV E0蛋白，为猪瘟基因工程疫苗以及动物乳腺生物反应器的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV和含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183菌株由西北农林科技大学农业部动物生物技术重点实验室保存(以下称本实验室)；pMD-18T载体由河南农业科学院动物分子免疫学重点实验室提供；293A细胞系、牛乳腺上皮细胞均由本实验室保存；EcoRⅠ、NotⅠ、PacⅠ和PmeⅠ限制性内切酶购自NEB公司；大肠杆菌DH5α感受态、T4DNA 连接酶，DNA Marker、Trizol、反转录试剂盒(SuperScriptTMRerverse Transcriptase)等均购自北京全式金生物技术有限公司；DNA胶回收试剂盒购自Axygen公司；质粒小量抽提试剂盒、无内毒素质粒小量提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；DNA连接试剂盒、实时定量SYBR○RPremix Ex TaqTM试剂盒购自TaKaRa公司；DMEM/F12、DMEM(HIGH GLUCOSE)、胎牛血清、脂质体2000购自GIBCO公司；鼠抗HIS抗体[anti-HIS(M)]和HRP标记的羊抗小鼠IgG购自北京全式金生物技术有限公司；细胞培养耗材均购自 Corning 公司。

1.2含CSFV E0基因的重组腺病毒质粒(pAd-hisE0)的构建

根据插入pMD-18T载体的CSFV E0全基因(hisE0， E0基因的5′端依次带有信号肽序列和His标签序列)为模板，设计1对特异性引物，引物序列如下：F1，5′-ACAGAATTCATGA- AGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGGCC-3′；F2，5′-ATTAGCGGCCGCTCAGGCATAAGCGCC- AAACC AGGTTTTG-3′，其中下划线为插入的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。通过PCR扩增后得到5′端依次带有信号肽序列和His标签序列的CSFV E0全基因(hisE0)，全长为765 bp。将其和腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV用EcoRⅠ/NotⅠ酶切回收，用T4DNA连接酶连接，获得pAdTrack-CMV-hisE0载体，酶切鉴定并测序。

用PmeⅠ限制酶酶切穿梭质粒pAdTrack-CMV-hisE0，然后转化含有腺病毒骨架载体 pAdEasy-1 的大肠杆菌 BJ5183 感受态，最终得到重组腺病毒质粒pAd-hisE0。用同样的方法制备重组腺病毒空载体质粒pAd-CMV作为阴性对照。

1.3重组腺病毒(Ad-hisE0)的包装及其有效性鉴定

培养293A细胞生长至底面积的80%～90%时，用Invitrogen Lipofectamine 2000将PacⅠ酶切线性化后的pAd-hisE0质粒转染293A细胞，步骤参考转染试剂说明书。转染后10 d左右，可观察到细胞变圆脱落，因病变出现空斑。此时便可收集细胞及细胞上清液，将此细胞悬液置于-0 ℃/38 ℃ 水浴中反复冻融3次，离心去除细胞碎片后收集上清，获得病毒液初代原液。然后用获得的病毒原液再次感染293A细胞，观察293A细胞的绿色荧光蛋白的表达情况，48 h后提取细胞总RNA反转录成cDNA，以牛的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因作为内参，实时定量PCR检测CSFV E0基因的相对表达量。实时定量 PCR引物信息见表1。

表1　实时定量PCR引物信息

1.4重组腺病毒的扩增、纯化及其滴度测定

将293A细胞培养到融合度为85%左右，用获得的病毒液初代原液感染293A细胞，3～4 d当细胞变圆脱落出现空斑时，收集细胞悬液于-80 ℃/38 ℃ 水浴中反复冻融3次，离心收集病毒上清液。重复上述步骤，大量扩增病毒，提高病毒的滴度。通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒，并测定滴度[11]。最终将收集到的含有CSFV E0基因片段的重组腺病毒命名为Ad-hisE0。采用同样的方法，制备重组腺病毒Ad-CMV，作为阴性对照。获得的重组腺病毒置于-80 ℃保存。

1.5重组腺病毒体外感染牛乳腺上皮细胞

将生长状态良好的牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cell,BME)接种于6孔板，细胞密度为1×105mL-1，加入含φ=10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。待细胞汇合率介于60%～70%时，按照不同的感染复数(MOI=5，25，50)加入含有CSFV E0基因的重组腺病毒Ad-hisE0，感染2 h后换液。培养48 h后观察绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞的比率，选择合适的MOI。72 h 后，收集腺病毒感染的牛乳腺上皮细胞及其上清，提取蛋白进行CSFV E0蛋白成分的SDS-PAGE和Western blot分析。用重组腺病毒Ad-CMV感染的对照样品采取相同的方法处理。

1.6重组腺病毒体内感染泌乳期山羊乳腺

选取处于自然泌乳期第1个月的山羊，平均每天的泌乳量约为1 L左右。每次对山羊乳房进行灌注或者收集样品时，用酒精和碘酒擦拭乳头。首先将山羊乳房内的乳汁全部挤净，然后通过乳头导管往乳池内注入生理盐水，轻轻按摩乳房，随后将生理盐水完全挤出。重复1次此过程，确保乳房内的残留乳汁被充分洗净。然后每只乳房灌注500 mL含36 mmol·L-1EGTA的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，按摩15 min后挤净。然后往右侧乳房内灌注滴度为1×1010GTU mL-1的重组腺病毒Ad-hisE0，左侧作为对照，灌注相同量的无菌PBS。乳房灌注的病毒量在400～600 mL，依乳房的容量而定，确保病毒液能充满整个乳池。灌注完后再次按摩乳房，使病毒液均匀的分布于乳池内并充分接触到腺泡内的分泌上皮细胞。灌注24 h后，将乳房内的乳汁全部挤净，并用生理盐水再冲洗1次。灌注48 h后，收集被感染山羊的乳汁冻存于-80 ℃。

1.7重组腺病毒灌注后山羊乳汁的收集和处理

将收集到的乳汁样品用分离缓冲液(10 mmol·L-1Tirs-HCl pH 8,10 mmol·L-1CaCl2)稀释5倍，在室温下用φ=10%的盐酸将其pH调至4.5。随后4 ℃，17 000×g离心30 min。收集乳清分装冻存于-80 ℃，用于后续的CSFV E0蛋白的SDS-PAGE和Western blot检测。

1.8重组蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析

将体外以及体内收集的蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后转印至PVDF膜，用含w=10%脱脂奶粉的TBST缓浊液(Tris盐缓冲液+吐温Tweon)4 ℃过夜封闭。然后用小鼠抗His的一抗稀释液(1∶1 000)，37 ℃孵育3 h；TBST洗3次后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG的二抗稀释液(1∶1 000)，室温孵育1 h；TBST洗3次，用增强型发光底物作用后转印至X光片。

2结果与分析

2.1重组腺病毒质粒pAd-hisE0的构建

用CSFV E0基因的扩增引物F1/F2，扩增前段带有信号肽序列和His标签序列的 CSFV E0基因片段，大小约为760 bp，结果与预期相符(图1)。将其连接入腺病毒穿梭载体后，用EcoRⅠ/NotⅠ双酶切鉴定穿梭载体pAdTrack-CMV-hisE0，结果与预期一致(图2)。测序结果表明，插入片段为765 bp，CSFV E0基因成功已插入重组腺病毒质粒。

M.Trans2K@ Plus DNA marker；1～4.CSFV E0 基因扩增产物Amplified products of CSFV E0 gene

图1CSFV E0基因的扩增产物

Fig.1PCR amplification of CSFV E0 gene

M.Trans15K@ Plus DNA marker；1.经EcoRⅠ/NotⅠ双酶切鉴定的穿梭载体pAdTrack-CMV-hisE0 pAdTrack-CMV-hisE0 plasmid double digestionedbyEcoRⅠ/NotⅠ；2.空载体对照Empty vector control

图2pAdTrack-CMV-hisE0的双酶切鉴定

Fig.2 Double enzyme identification of pAdTrack-CMV-hisE0

2.2重组腺病毒Ad-hisE0有效性的鉴定

用包装获得的重组腺病毒Ad-hisE0和Ad-CMV分别感染293A细胞，24 h后观察绿色荧光。绿色荧光蛋白在细胞中已表达，说明腺病毒已包装成功并且成功感染293A细胞(图3)。48 h后提取总RNA进行反转录，实时定量PCR检测CSFV E0基因的表达量(图4)。结果显示感染Ad-hisE0病毒的细胞CSFV E0基因的表达量极显著高于感染Ad-CMV病毒的对照组。说明腺病毒包装成功，并且能有效转录CSFV E0基因。

A.腺病毒Ad-hisE0感染的293A细胞(暗场) 293A cells infected by Ad-hisE0(fluorescence)；B.腺病毒Ad-hisE0感染的293A细胞(明场) 293A cells infected by Ad-hisE0(under bright field)

图3腺病毒感染293A细胞24 h绿色荧光表达(×40)

Fig.3Green fluorescence of 293A cells infected by recombinant adenovirus for 24 h (×40)

图4　CSFV E0基因相对表达量

2.3体外感染牛乳腺上皮细胞

用获得的重组腺病毒Ad-hisE0感染牛乳腺上皮细胞，48 h后观察绿色荧光，绿色荧光蛋白表达(图5)，说明腺病毒对牛的乳腺上皮细胞感染成功。从中选出最合适的MOI为25。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析证实，被重组腺病毒Ad-hisE0侵染的牛乳腺上皮细胞表达的蛋白可与抗His抗体发生特异性免疫反应，在26 ku和48 ku左右分别出现2条明显的条带，分别对应未糖基化的E0蛋白和糖基化完全的E0蛋白，与预期结果相符。证实CSFV E0蛋白在牛乳腺上皮细胞中的表达。而感染Ad-CMV的细胞培养物则没有出现相应蛋白条带(图6)。证明构建的腺病毒具有侵染哺乳动物细胞的能力，并能介导细胞表达和分泌E0蛋白。

A、B.MOI为5的转染组(明场与暗场) Infected group with a MOI of 5 (under bright field and fluorescence)；C、D.MOI为25的转染组(明场与暗场) Infected group with a MOI of 25 (under bright field and fluorescence)；E、F.MOI为50的转染组(明场与暗场) Infected group with a MOI of 50 (under bright field and fluorescence)；G、H.未转染组(明场与暗场) None-infected group(under bright field and fluorescence)

图5不同MOI下腺病毒感染牛乳腺上皮细胞3 d 绿色荧光蛋白表达(×40)

Fig.5Green fluorescence of borine marrmary epithelial cells infected by recombinant for 3 d at different MOI (×40)

1.Ad-CMV感染的牛乳腺上皮细胞Ad-CMV infected bovine mammary epithelial cell；2.Ad-hisE0感染的牛乳腺上皮细胞Ad-hisE0 infected bovine mammary epithelial cell

图6腺病毒感染牛乳腺上皮细胞后

重组蛋白的Western blot分析

Fig.6Western blot analysis of recombinant protein CSFV E0 from the bovine mammary epithelial cells infected by recombinant adenovirus

2.4体内感染泌乳期山羊乳腺

将纯化处理后的乳汁样品进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示，灌注Ad-hisE0重组腺病毒的乳汁样品，在26 ku和48 ku处有明显条带，分别为未发生糖基化的E0蛋白和糖基化完全的E0蛋白，与预期大小一致(图7)。而作为对照的灌注重组腺病毒Ad-CMV的乳汁样品则未发生特异性反应。说明构建的重组腺病毒成功介导了CSFV E0基因在山羊乳腺中的分泌。

1.Ad-hisE0感染的山羊乳腺 Ad-hisE0 infected goat mammary gland；2.Ad-CMV感染的牛乳腺上皮细胞 Ad-CMV infected goat mammary gland

图7 腺病毒感染山羊乳腺后重组蛋白的Western blot分析

Fig.7Western blot analysis of recombinant protein CSFV E0 secreted from the goat mammary gland infected by adenovirus

3讨论与结论

猪瘟在全世界很多地方流行，而免疫接种是保护动物免于猪瘟感染的唯一途径。目前针对猪瘟研制的几类疫苗有减毒活疫苗、亚单位疫苗以及基因工程疫苗，但减毒活疫苗仍处主流地位[13]。然而由于免疫程序不合理，免疫剂量未达到最佳标准或者操作不规范，减毒活疫苗有时并不能提供有效的保护。利用基因工程技术表达的重组蛋白具有更高的安全性和抗原性，与传统的疫苗相比是一种更为有效的免疫方法[14]。CSFV可编码C、E0、E1和E2四种结构蛋白，其中最具免疫防治研究价值的是E0和E2。E0既是一种结构蛋白，也是一种功能性蛋白，表现出神经细胞毒性和抗凝集活性，与CSFV对宿主细胞的嗜性以及致病力有密切联系，具有RNase活性[15-16]，能引起动物的淋巴和上皮细胞凋亡，导致免疫抑制[17]。E0是唯一一种能分泌到被CSFV感染细胞的培养上清液中的糖蛋白[17]，且较E2保守程度更高，可刺激机体产生中和抗体，获得对猪瘟的免疫力[18]。因此利用基因工程技术表达CSFV的E0蛋白，进而将其作为一种亚单位疫苗是防治猪瘟的一个非常有前景的探索方向。

为将想要的目的蛋白用于研究和生产，大量表达外源蛋白的方法一直被人们广泛关注。通常表达外源蛋白的方法包括以大肠杆菌为主的原核表达，和以酵母细胞表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统为主的真核表达。在转基因哺乳动物的乳腺中表达重组蛋白，可保证获得的重组蛋白得到接近于自然状态下的翻译后修饰[19]。然而，生产转基因动物的高昂费用以及其较长的周期阻碍其在生产低成本疫苗方面的应用[20-21]。因此，另一种较为可行的方法是将想要表达的目的蛋白的基因直接导入成年动物的乳腺中。

将外源基因导入真核细胞的方法有很多种，主要包括脂质体介导的化学方法、利用电转等手段的物理方法以及携带外源基因的病毒或农杆菌等介导的生物学方法。然而，考虑到对细胞的损伤以及应用于活体试验的可操作性，利用病毒介导的生物学方法是一种更为理想的将目的基因导入哺乳动物乳腺的方法。腺病毒与其他病毒载体系统相比，具有可感染体内组织、容易快速获得高滴度病毒和可以携带大片段外源基因等优点[22-24]。

CSFV E0蛋白是一个大小为48 ku左右高度糖基化糖蛋白，其分子量中约50 %左右都为碳水化合物组成。本试验中，无论是在牛乳腺上皮细胞中还是在山羊乳腺中，Western blot都显示出2条条带，一条为26 ku左右，另外一条为48 ku左右。表明乳腺上皮细胞对E0蛋白的糖基化修饰程度不同，有的修饰较为完全，有的则可能并未经过糖基化修饰。在以往的报道中，利用不同细胞系表达的E0蛋白大小也不尽相同，如Chen等[25]利用杆状病毒在Sf9细胞表达的E0蛋白大小为38～40 ku，而在High Five细胞中表达的E0蛋白大小则在52 ku左右。这主要是由于在不同的细胞糖基化水平不同，最终导致表达的重组蛋白E0的大小略有差别。此外，还有研究表明乳腺对外源重组蛋白的翻译后修饰存在一个“速率限制”，当蛋白的表达量大于某个浓度时，乳腺对重组蛋白的糖基化修饰会不完全。如对抗凝血酶Atryn[26]和人的人体C1酯酶抑制剂[27]，当其在乳汁中的表达量大于1 mg/mL时，蛋白的完全和正确糖基化修饰就会受到阻碍。因此，本试验中乳腺上皮细胞对于E0蛋白的糖基化修饰极有可能也存在上述现象，其具体原因仍需要进一步探究。

本研究中首先克隆5′端带有信号肽序列和His标签序列的CSFV E0基因，构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-hisE0以及腺病毒重组质粒pAd-hisE0，并将其成功包装成为高质量的重组腺病毒。经扩增纯化后进行体内和体外试验，分别用该重组腺病毒感染293A细胞、牛的乳腺上皮细胞和泌乳期山羊乳腺。实时定量检测，SDS-PAGE和Western blot分析结果显示，构建的重组腺病毒具有侵染哺乳动物细胞的能力，并能介导山羊乳腺表达和分泌E0蛋白。

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Received 2015-04-29Returned2015-06-09

First authorSHAO Minghao,female,master student.Research area:animal embryo engineering.E-mail:shaominghao90@163.com

(责任编辑：史亚歌Responsible editor:SHI Yage)

Recombiant Adenoviral-mediated Transfer of CSFV E0 Gene into Goat Mammary Gland

SHAO Minghao，ZHUO Weiwei，HE Xiaoli，LIU Jun，QUAN Fusheng and ZHANG Yong

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China)

AbstractIn order to synthesize the goat mammary gland and CSFV E0 gene,a CSFV E0 gene with a signal peptide and a His tag sequence in its upstream was inserted into the recombinant adenovirus plasmid by an adenovirus shuttle vector.And then the recombinant plasmid was transfected into 293A cell line to package the recombinant adenovirus Ad-hisE0.To verify the availability of the virus,293A cells were infected by the resulting recombinant adenovirus (Ad-hisE0).The result of quantitative real-time PCR showed that the expression of CSFV E0 increased dramatically after infected with the adenovirus.And then the confirmed Ad-hisE0 was used to infect bovine mammary epithelial cells in vitro and goat mammary cells in vivo.The expression products were analyzed by SDS-PAGE and Western blot.The result revealed that there are two different molecular mass of the recombinant fusion protein 26 ku and 48 ku.These results demonstrated that the recombinant adenovirus Ad-hisE0 can introduce the CSFV E0 gene into the goat mammary gland,and enable the secretion of the recombinant protein.

Key wordsCSFV；E0 protein；Adenovirus；Mammary gland

收稿日期：2015-04-29修回日期：2015-06-09

基金项目：抗病转基因牛新品种培育(2008ZX08007-004)。

通信作者：张涌，男，教授，主要从事动物克隆与转基因技术、动物胚胎工程研究。E-mail：Zhy1956@263.net

中图分类号S855.3

文献标志码A

文章编号1004-1389(2016)06-0816-07

Foundation itemBreeding of Disease Resistant Transgenic Cattle(No.2008ZX08007-004). ZHANG Yong,male,professor.Research area:animal cloning and transgenic technology,animal embryo engineering.E-mail: Zhy1956@263.net

网络出版日期：2016-06-01

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0914.008.html

第一作者：邵明豪，女，硕士，研究方向为动物胚胎工程。E-mail：shaominghao90@163.com