兰州黑白花奶牛耳缘组织细胞系的建立

徐水林，马　伟，马桂兰，马　花，马卫国，乔自林*（.西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；.兰州民海生物工程有限公司，甘肃兰州73000）



兰州黑白花奶牛耳缘组织细胞系的建立

徐水林1，2，马伟1，马桂兰2，马花1，马卫国1，乔自林1*
（1.西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；
2.兰州民海生物工程有限公司，甘肃兰州730010）

摘要：目的：通过耳缘组织细胞的分离培养和保存，在细胞水平上保存兰州黑白花奶牛的种质资源。方法：采用植块法培养兰州黑白花奶牛的耳缘组织原代细胞，经传代扩大培养后在液氮中冷冻保存，并对保存的耳缘组织细胞系进行了复苏活力、形态、生长特性、微生物和内、外源病毒因子检查。结果：兰州黑白花奶牛耳缘组织植块培养时第4天可见细胞从植块边缘生长，第6天消化传代后生长变快，形态以上皮型为主。冷冻保存的兰州黑白花奶牛耳缘细胞系复苏活力达95%，生长良好，生长曲线呈近“S”型，最大增殖浓度3.36×105/ml，对数生长期倍增时间为24 h，无菌、支原体和内、外源病毒因子检查为阴性。结论：成功建立了兰州黑白花奶牛耳缘组织细胞系，使这一物种的种质资源在细胞水平上得以长期保存。

关键词：兰州黑白花奶牛；耳缘组织；细胞系

兰州黑白花奶牛是经过四十多年的杂交选育培育出的一种适应于西北地区环境条件的乳用牛品种，是甘肃省地方牛品种荷斯坦奶牛——甘肃类群的重要组成部分，现为以兰州市花庄奶牛繁殖场为核心的扩繁群为中心以及兰州市城乡结合部的散养分布特征［1，2］。自国家实施自然科技资源共享平台项目《畜禽种质资源收集、整理与保存》和《家养动物种质资源平台》以来，先后有几百个品种的家养和野生畜禽的种质资源在细胞或基因水平上得到了保存，兰州黑白花奶牛仍以传统的建立纯种群和扩繁群方式，通过品种选育实施原位保存，投入大见效慢，实践证明，实施体细胞保存投入小保存期长。兰州黑白花奶牛是经长期人工培育形成的甘肃地方品种，在体貌特征、生产性能和适应性等方面已形成了品种特征，其种质资源应有多方面的保护措施，为此开展了其耳缘组织的细胞建系工作。

1　材料与方法

1.1材料

兰州黑白花奶牛耳缘组织采自兰州花庄奶牛繁殖场出生的新生小牛公母各两头。DMEM（Gibco，货号：02- 5062EJ）、0.2%胰蛋白酶（兰州百灵生物，批号：20140425）、胎牛血清（兰州民海生物，批号：20140715，添加比例为10%）、DMSO（ThermoFisher，货号：20688）、无菌和支原体检查培养基（北京三药）、病毒荧光抗体结合物（VMRD）、病毒检查用细胞（本室保存）、鸡和豚鼠红细胞等。主要仪器设备有CO2培养箱（Thermo，3111型）、倒置相差显微镜（Olympus，CK40- 32PH型）、荧光倒置相差显微镜（Olympus，IX71型）和液氮罐（乐山东亚）等。

1.2方法

1.2.1原代培养新生小牛刚采集完血液后剪下耳朵，标记个体性别后，放入装有冻袋的泡沫箱中6 h内带到实验室。先用纯净水流水反复搓洗表面污垢，在75%酒精中完全浸泡5～10 min。浸泡结束后在无菌PBS中用眼科镊反复刮洗，期间不断更换清洗器皿和PBS使表面彻底消毒。剪弃边缘部分，留约2 cm大小的组织，剥去皮肤连同软骨剪成1 mm3大小的组织块，每间隔2 mm均匀辅在细胞瓶的生长面，反转细胞瓶使生长面朝上加入含血清的培养液，置37℃5%CO2培养箱培养，过夜后轻轻翻转细胞瓶，使组织块完全浸泡在培养液中，从培养的第3天起观察细胞的生长情况。原代培养标记为P0代，传代后按P1、P2……标记。

1.2.2传代培养和冻存显微镜下观察有较多地组织块边缘见细胞长成单层后，用胰蛋白酶消化细胞在原培养瓶中传代培养（即传代比例1∶1）。此后细胞生长成致密单层后按1∶3比例传代，到培养P3时扩大培养数量，在该代次对数生长期末期消化后按1.0× 106/ml左右密度在液氮中（- 196℃）冻存，冻存保护液为10%DMSO+20%胎牛血清+70%DMEM。每个个体的耳缘细胞冻存30支，每支装量1 ml。

1.2.3细胞鉴定按文献方法检查复苏活力［3］、观察细胞形态、绘制生长曲线［4］、检查无菌和支原体［5］以及致细胞病变病毒、血细胞吸附病毒和特异的病毒因子［6］。

2　结果

2.1原代培养

兰州黑白花奶牛耳缘组织原代培养时在第4天可见部分组织块的边缘有细胞长出，多为不规则形分散生长（如图1a）。到第6天时大多数植块边缘有成片的单层细胞，以成纤维形细胞为主，细胞相互间隙较大，细胞并不致密（如图1b）。

2.2传代培养

对原代培养的细胞首次传代以后细胞生长速度变快，P1代在48 h成致密单层细胞，此后按1∶3比例传代时均在72 h成致密单层细胞，细胞间连接紧密，以不规则成纤维状细胞为主，也见有规则扁平的上皮样细胞，视野中漂浮的死细胞极少（如图1c），说明细胞活力高长势好。

图1　兰州黑白花奶牛耳缘细胞系形态图（a.原代培养第4天；b.原代培养第6天；c.P3，48 h）

2.3细胞冻存

对P3代细胞在液氮中冻存的平均密度为1.24× 106/ml，平均活力为97.5%。

2.4细胞鉴定

2.4.1复苏活力耳缘细胞平均复苏活力为95.2%，比冻存前略有下降。

2.4.2细胞形态复苏的细胞培养48 h时长成较致密单层，按1∶3比例传代后72 h长厉致密单层细胞，形态与冻存前的P3代相似。

2.4.3生长特征兰州黑白花奶牛耳缘细胞的生长曲线呈“S”型，如图2所示。可以看出，前24 h为潜伏期，细胞增殖较慢，说明低密度接种时潜伏期长。48～120 h为对数生长期，144 h进入平台期直到216 h才进入衰退期，细胞维持培养时间较长。平均最大增值浓度为3.36×105/ml，群体倍增时间较长为41.8 h，而对数生长期的倍增时间较短只有24 h。

图2　兰州黑白花奶牛耳缘细胞系的生长曲线图

2.4.4无菌检查培养细胞的培养基检查细菌和真菌培养7 d均没有菌生长。

2.4.5支原体检查培养细胞的培养基在支原体液体基中培养14 d颜色没有变化，在固体培养基中培养14 d也没有菌落生长；细胞冻融处理的上清液接种Vero细胞上荧光染色后，只观察到细胞核有蓝色荧光其他部位没有荧光，如图3。

图3　兰州黑白花奶牛耳缘细胞系支原体荧光法检查结果图（a.阳性对照；b.阴性对照；c.被检细胞）

2.4.6内、外源病毒因子检查细胞培养直接观察和血吸附试验细胞形态正常，无血细胞吸附现象；细胞冻融处理的上清液接种Vero和MRC- 5细胞培养观察和血凝试验的两种细胞形态均正常，血凝试验均为阴性；用荧光抗体结合物检查BVDV、REO和BPV，均没有病毒的特异性荧光产生，说明保存的细胞没有被内、外源病毒污染，如图4。

图4　兰州黑白花奶牛耳缘细胞系病毒检查结果

3　结论

畜禽种质资源是以物种为单元的遗传多样性资源，是关系到畜牧业可持续发展和生物多样性以及人类社会可持续发展的重要物质基础。动物的体细胞包含物种的全部遗传信息，构建畜禽种质资源细胞库，可实现对种质资源的永久保存［7］。兰州黑白花奶牛是甘肃省优良地方品种，用植块法培养的新生小牛耳缘组织细胞生长良好，没有细菌、真菌、支原体和内、外源病毒污染，使这一重要物种的种质资源在细胞水平上得以保存，也为相关学科研究提供理想的生物材料。

参考文献：

［1］赵国琳.甘肃省地方畜禽品种资源［M］.兰州：甘肃科学技术出版社，2013.

［2］孙连科.兰州黑白花奶牛泌乳规律及其分布［J］.甘肃畜牧兽医，1988，（06）：7.

［3］乔自林，冯玉萍，李明生，等.兰州大尾羊耳缘组织成纤维细胞系的建立［J］.黑龙江农业科学，2012，（10）：64-68.

［4］李玲，李雪峰.细胞生物学实验［M］.长沙：湖南科学技术出版社，2003.

［5］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典三部2010年版［M］.北京：中国农业出版社，2011.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典三部2010年版［M］.北京：中国医药科技出版社，2010.

［7］中国科学院生物多样性委员会.生物多样性（译）［M］.北京：中国科学技术出版社，1990.

（编辑：高真贞）

中图分类号：S826.89

文献标识码：B

文章编号：1006- 799X（2016）05- 0065- 03

基金项目：兰州市科技计划项目（2006- 2- 59），甘肃省科技支撑项目（144FKCA082）。

作者简介：徐水林（1983-），男，甘肃临洮人，工程师，主要从事动物细胞培养技术研究。

通讯作者：乔自林（1976-），男，甘肃永靖人，高级实验师，主要从事动物细胞培养技术研究。