3株中度嗜盐菌的分离鉴定与生长特性研究

周芳芳，熊涛

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

3株中度嗜盐菌的分离鉴定与生长特性研究

周芳芳，熊涛

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

[摘要]将湖北省荆州拍马造纸厂的高盐污水，采用平板划线法筛选并纯化培养后，得到3株单菌落，通过观察菌落的颜色、形状和鞭毛等特征，将菌液进行革兰氏染色试验、需氧性试验和淀粉水解等生理生化试验，可将这3株菌株初步鉴定为盐单胞菌属(Halomonas)，都属于中度嗜盐菌。耐盐度试验结果显示，3株菌株能在1.5%～20.0%NaCl中生长，且最适生长浓度为12.0%。pH生长试验表明最适生长pH为7.0。

[关键词]高盐污水；中度嗜盐微生物；盐单胞菌属(Halomonas)

中度嗜盐菌的分布广泛,盐生长浓度宽(但通常要低一些),对营养的要求低，易于适应环境[3]。中度嗜盐菌的用途很广泛且由来已久，比如Tetragenococcus的菌株很久以前就被用于食品如酱油等的发酵中。人们对它们潜在的生物技术应用充满了兴趣。目前对中度嗜盐菌应用方面的研究主要集中在对它们产生的酶和一些功能性分子、大分子多聚物以及生物环保等方面[4,5]。本研究从高盐污水中分离出3株嗜盐菌，通过对不同盐浓度下的生长情况及生理生化特性分析，确定为中度嗜盐菌,可为研究中度嗜盐菌在生物技术应用提供参考。

1材料与方法

1.1材料

试验所用高盐污水来自湖北省荆州拍马造纸厂。

1.2方法

1.2.1培养基配制

CM培养基:将酸性水解酪蛋白7.5g、酵母浸出物10g、柠檬酸钠3g、MgSO4·7H2O 20g、KCl 2g、柠檬酸铁0.004g、NaCl 98.9g加水至1000mL[6]。

Gibbons改良培养基:将酪蛋白氨基酸5g、酵母浸出物10g、细菌蛋白胨5g、柠檬酸钠3g、KCl 2g、MgSO4·7H2O 20g、NaCl 120g、琼脂18g加水至1000mL[7]。

ATCC213培养基: MgSO4·7H2O 20g、KCl 5g、CaCl2·6H2O 0.2g、酵母提取物10g、Tryptone 5g、NaCl 180g加水至1000mL[8]。

1.2.2菌株的筛选、分离与纯化

菌株的筛选：采用恒温摇床培养,各取0.2mL水样分别加入到3支装有150mL CM培养基的三角瓶中,放入到30℃150r/min的摇床中培养5d。

菌株的分离：将培养液稀释到10-6,准确吸取适当稀释度的菌液0.1mL均匀涂布在含12%NaCl Gibbons平板上,在37℃培养24h,观察菌落形态[9]。

菌株的纯化：分别用接种环挑取不同菌落,用划线法在改良的Gibbons培养基上纯化分离出来的菌种,固体培养于加有少量蒸馏水的塑料袋中,放入37℃恒温培养箱中培养1周后挑选单菌落,反复划线,直至获得纯菌[10]，并做好标记。

1.2.3形态学特征观察

观察菌落形状、颜色、大小、湿度、透明度、边缘及有无鞭毛等形态特征。

1.2.4耐盐菌和嗜盐菌的鉴别

将分离纯化的菌株分别浸泡在蒸馏水中放置24h后，用光学显微镜观察到这3种菌有变形和破壁的现象发生。

1.2.5生理生化特性试验

包括革兰氏染色试验、甲基红试验、需氧性试验、明胶液化试验、纤维素分解试验、乙酰甲基醇反应、柠檬酸反应，是否产生吲哚、产氨试验，是否水解淀粉试验。

1.2.6最适生长pH的测定

将所分离出来的3株菌株按2% 的接菌量分别接入到不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的改良Gibbons固体培养基中，37℃培养，观察是否生长并做好标记。

1.2.7耐盐性测定

配制NaCl%为0.0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0的ATCC213液体培养基，以5%的接菌量接种，37℃摇床振荡培养2～7d，用722型分光光度计于 460nm波长处测光密度值。

1.2.8药敏试验

将分别浸有青霉素、卡拉霉素、庆大霉素、氯霉素、氧氟沙星和利福平等抗生素的厚滤纸片放在预先涂布好细菌的Gibbons培养基上，于37℃培养，观察抗菌素对它们有无抑制作用。

2结果与分析

2.1菌落形态

图1　初次筛选的菌落形态

经过初筛，分离出淡粉色、乳白色、橙黄色3种颜色的菌落(图1)。淡粉色菌落为小的圆形菌落，规则、湿润、有光泽；乳白色菌落为大而不规则的圆形菌落，湿润、有光泽；橙黄色菌落为大的圆形菌落，规则、湿润、有光泽。

采用划线平板法将3种颜色的菌落分别纯化培养后，得到3株菌株分别暂定为1号(淡粉色)、2号(乳白色)、3号(橙黄色)菌株。其形态特征分别如图2和表1所示。

由文献[11]可知，嗜盐菌和耐盐菌多数呈淡乳色、淡粉、淡黄及橙黄色的圆形菌落。为此，将3种菌株分别浸泡在蒸馏水中放置24h后，用光学显微镜观察到这3种菌株是否有变形和破壁的现象发生，以鉴别它们是耐盐菌还是嗜盐菌。试验结果表明，3种菌株在蒸馏水中放置24h有变形和破壁现象。根据文献[12]可判定分离出来的3种菌株并不是耐盐菌，而为嗜盐菌。

图2　3种颜色的菌落纯化培养结果

1号菌株2号菌株3号菌株颜色淡粉乳白橙黄细胞形状杆状杆状短杆运动性+--鞭毛单鞭毛周毛周毛

表2　3株菌株的生理生化特性

注：“+”阳性；“-”阴性。

表3　菌株在不同pH下生长情况

注：“”表示生长良好；“+”表示生长；“-”表示不生长。

2.2生理生化特征

3种菌株的生理生化试验结果如表2所示。根据生理生化特性，结合菌落的形态特征，也可初步判定分离的3株菌株是嗜盐菌。

图3　不同NaCl浓度下3株菌株的生长情况

2.3最适生长pH

菌株在不同pH下生长情况如表3所示，可见3株菌株生长的最适pH均为7。

2.4耐盐度曲线

3种菌株的最适NaCl浓度均为12.0%，且在盐浓度低于1.5%和高于20.0%时均不生长，从图3明显可见3种菌株的生长速度依次是：2号>3号>1号。

2.5药敏试验结果

1号菌株对氯霉素、利富平、氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素敏感，对氧氟沙 星不敏感；2号菌株对氯霉素、利富平、氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素敏感，对氧氟沙星不敏感，且生长旺盛；3号菌株对氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、氧氟沙星不敏感，但对氯霉素、利富平敏感。

3讨论

根据其形态及生理生化、药敏试验结果并参考伯杰氏细菌手册可知，本研究分离出的3种菌株符合盐单胞菌属的特征，即能在含1.5%～20.0%NaCl的培养基中生长,其最适NaCl生长浓度为12.0%,在蒸馏水中有变形和破壁的现象,为革兰氏阴性杆菌,好氧或兼氧,极生丛毛运动或不运动,不液化明胶,产H2S,pH生长范围在5.5～8.0之间,最适pH在7.0左右。但具体种类还有待于DNA杂交以及16S rDNA序列分析后才能最终做出结论。

由于造纸厂废水、砷矿废水及许多人类活动造成的小环境是高盐或高盐碱的，而中度嗜盐菌在这类环境中可以很好地生存，而且中度嗜盐菌作为最基础的代谢者，配合着酵母、原虫等其他微生物，可以将许多对人类和动植物有害的物质改造成为低害甚至无害的物质释放出来，所以，中度嗜盐菌的这一生理特点，使得其在环保方面有良好的应用前景。

[参考文献]

[1]安立超，严学亿，胡磊，等.嗜盐菌的特征与高盐废水生物处理的进展[J].环境污染与防治，2002，24(5)：194～195.

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[3]韦娜.嗜盐菌的分离鉴定及其应用研究[D].青岛：中国海洋大学，2012.

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[10]沈萍.微生物学[M].北京：高等教育出版社，2000：87～90.

[11]迪丽拜尔·托乎提，徐晓晶.新疆艾丁湖及邻近地区嗜盐菌和耐盐菌的数量分布[J].生态学报，2001，21(8)：1387～1391.

[12]曾静，窦岳坦，杨苏声.新疆地区盐湖的中度嗜盐菌的16S rDNAPCR-RFLP分析[J].微生物学通报，2000，27(5)：327～330.

[收稿日期]2016-02-28

[作者简介]周芳芳 (1989-)，女，硕士生，研究方向为动物基因工程疫苗。通信作者：熊涛，xiongtao@hotmail.com。

[中图分类号]X172

[文献标识码]A

[文章编号]1673-1409(2016)15-0059-04

[引著格式]周芳芳，熊涛.3株中度嗜盐菌的分离鉴定与生长特性研究[J].长江大学学报(自科版) ，2016，13(15)：59～62.