Ki-67在犬乳腺肿瘤的表达与分析

卫顺生1，2，王华南2，3，胡　杨2，杜宏超2，李越华4，裴世敏2，杨　旭2，张　红2，周　斌2，张　迪2，金艺鹏2，林德贵2（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032；2.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193；3.浙江大学动物科学学院，浙江杭州310012；4.太原博爱宠物医院，山西太原030024）



Ki-67在犬乳腺肿瘤的表达与分析

卫顺生1，2，王华南2，3，胡杨2，杜宏超2，李越华4，裴世敏2，杨旭2，张
红2，周斌2，张迪2，金艺鹏2，林德贵2
（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032；2.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193；3.浙江大学动物科学学院，浙江杭州310012；4.太原博爱宠物医院，山西太原030024）

摘要：本试验通过免疫组化的方法，检测了从中国农业大学教学动物医院收集到的6个正常乳腺组织和135例乳腺肿瘤组织（良性30例，恶性105例）Ki-67的表达率。结果犬乳腺肿瘤组织中的Ki-67蛋白表达率明显高于正常乳腺组织（P<0.05）；犬恶性肿瘤组织中的Ki-67蛋白表达率明显高于良性肿瘤（P<0.05）。表明Ki-67在恶性肿瘤里高表达，可以作为犬乳腺肿瘤疾病诊断的指标。

关键词：犬乳腺肿瘤；Ki-67蛋白；免疫组化；恶性肿瘤；良性肿瘤

1　材料与方法

1.1动物材料采集自2012年5月至2013年6月间，中国农业大学教学动物医院临床确诊的乳腺肿瘤患犬的肿瘤病料135例，其中良性肿瘤（30例），包括良性混合瘤（10例）、混合腺瘤（8例）、导管乳头状瘤（12例）;恶性肿瘤（105例），包括实体癌（60例）、导管乳头状癌（25例）、纤维肉瘤（5例），原位癌（5例）和混合癌（10例）；以及健康试验犬正常组织（6例）。患犬年龄在3～20岁之间，平均年龄8.98±3.73岁。无菌手术器械对肿瘤不同部位进行取材，无菌生理盐水冲洗后，用10倍体积的4%中性甲醛固定液固定。

1.2主要试剂及仪器Ki-67单克隆抗体、DAB显色试剂盒、PV9000通用型，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；切片机、摊片机、烤片机、组织包埋、光学显微镜、载玻片。

1.3试验方法对所有收集到的乳腺肿瘤组织进行Ki-67免疫组织化学染色。免疫组织化学染色方法参照文献[8]。简要步骤如下：将上述固定的乳腺组织用组织包埋机进行石蜡包埋；每个石蜡组织至少制备2张0.3 μm的切片；第一张切片制备H.E.染色，进行病理学分类;另一张组织切片经过脱蜡、水化、修复抗原、封闭、加一抗、加二抗、显色等过程完成Ki-67的免疫组织化学染色。

1.4结果判定标准及分析方法对Ki-67蛋白的免疫组化染色以细胞核出现棕黄色颗粒而细胞质无染色者为Ki-67蛋白表达阳性，结果判定以阳性细胞所占百分比表示，即高倍镜下随机选取10个视野，每个视野计数100个细胞，以阳性细胞占细胞总数百分数进行阳性细胞表达量进行统计。采用社会科学统计软件包（Statistical Package for social sciences，SPSS）19.0版统计软件对所得数据进行统计学处理，统计学软件选用fisher's精确检验法、Pearson相关分析进行检验。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。

2　结果

2.1Ki-67蛋白在正常乳腺组织中的表达从中插彩版图1可看出，Ki-67主要表达于细胞核，大部分正常乳腺组织几乎不表达（中插彩版图1-A），只有一少部分正常乳腺组织少量表达Ki-67（中插彩版图1-B）。

2.2Ki-67蛋白在乳腺肿瘤的表达从中插彩版图2可看出，Ki-67在良性肿瘤中的表达量很低，几乎不表达，而在犬乳腺癌中高表达，主要高表达于腺上皮细胞核。少量表达于肌上皮，纤维细胞较少表达。

2.3Ki-67蛋白表达在乳腺组织的表达量及与肿瘤良恶性的关系按照免疫组化结果的判定标准，如表1所示，我们列出Ki-67在犬乳腺的不同组织类型及乳腺肿瘤的不同组织学分型之间的表达量分布情况。结果显示，不同组织学分型的肿瘤之间具有显著性差异，P<0.01；对照组（n=6）Ki-67阳性表达的细胞数值范围为1.04%±1.85% （0～5%）；肿瘤组（n=135）Ki-67阳性表达细胞数值范围为24.26%±26.88%（0～90%）；其中良性肿瘤（n=30）Ki-67阳性表达细胞数值为6.83%± 4.49%（0～10%）；恶性肿瘤（n=105）Ki-67阳性表达细胞数值为29.24%±28.50%（0～90%）。以Ki-67蛋白表达量50%为临界值，采用Fisher′s检验Ki-67表达与犬乳腺肿瘤良性与恶性的关系，如表2所示，Ki-67蛋白表达在正常乳腺与肿瘤之间不存在显著性差异，P>0.05（P=0.3471）；在良性与恶性肿瘤之间表达量也存在显著差异P<0.05 （P=0.00096）。

表1　Ki-67在犬乳腺肿瘤中的表达情况

3　讨论

本试验共收集到乳腺肿瘤组织135例，其中恶性肿瘤105例，所占比例为77.8%，其值高于国外的50%，因为国内一般等肿瘤变得很大才进行手术治疗，这时肿瘤往往已经发生转移和恶化。有很多病理学家把包膜具有完整性的肿瘤直接被划分为良性肿瘤，但这并不科学，因为肿瘤恶性程度主要取决于核分裂相、细胞的异型性、核质比等诸多因素，主要根据病理结果进行定论。本试验中如果局部出现恶性程度高的区域，即使其他部分较良性且包膜完整，我们也将之化分为恶性肿瘤，有利于控制肿瘤的发展；另外，对于长有多个肿瘤的病例，我们只统计恶性程度最高的那一个肿瘤作为整只犬的病理结果，利于及早进行癌症治疗。

Ki-67蛋白存在于增殖细胞核，是一种非组蛋白核蛋白，由345 kD、395 kD的两条多肽链组成[9]。Ki-67抗原在Gl中期到晚期出现，S期和G2期逐渐增加，M期达到最高值，M期后迅速，其半衰期短。Ki-67作为一种与细胞周期相关的增殖细胞核蛋白，只与增生细胞核反应，无组织特异性，是一个界定细胞凋亡和增殖的有价值的标记物。Ki-67能准确地反映肿瘤细胞的增殖活性，其与多种肿瘤的发展、转移及预后有关。在人类肿瘤研究领域，Ki-67的表达变化能较好的反映肿瘤增殖活性、对判断肿瘤的恶性程度、预后和指导肿瘤的术后辅助治疗有着极其重要的意义[10]。

本试验显示，犬乳腺肿瘤组织中的Ki-67蛋白阳性率明显高于正常乳腺组织，表明肿瘤细胞的核增殖性比正常乳腺细胞活跃，对肿瘤的诊断具有重要的意义；此外，我们还发现，犬恶性肿瘤组织中的Ki-67蛋白阳性率明显高于良性肿瘤，对肿瘤的预后分析具有重要的诊断意义。本试验结果与人类医学相关研究结果一致。我们的研究结果提示Ki-67是犬乳腺肿瘤的一个良好的生物标记物，可作为犬乳腺肿瘤的预后指标。

表2　Ki-67蛋白的表达与犬乳腺肿瘤临床病理学特征的关系

参考文献：

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[8] Huanan W，Xu Y，Yipeng J，et al.Expression and significance of CHIP in canine mammary gland tumors[J].J Vet Med Sci，2015，77：1465-1471.

[9] MacCallum D E，Hall P A . The location of pKi67 in the outer dense fibrillary compartment of the nucleolus points to a role in ribosome biogenesis during the cell division cycle[J] . J Pathol，2000，190：537-544.

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中图分类号：S858.292

文献标志码：B

文章编号：0529-6005（2016）05-0038-02

收稿日期：2015-12-31

基金项目：国家自然科学基金（31572578；31372489）

作者简介：卫顺生（1964-），男，助理研究员，博士，从事宠物诊疗动物外科手术及中兽医和针灸工作，E-mail：tyboaipet@126. com

通讯作者：林德贵，E-mail：csama@sina.com乳腺肿瘤是犬最常见的肿瘤之一，大约50%的犬乳腺肿瘤属于恶性肿瘤，并且手术切除之后，往往复发率较高[1]。目前，肿瘤标记物可以用于肿瘤的检测、诊断、评估癌症风险、监测疾病的复发和预测疾病的预后，因此找到良好的肿瘤标记物意义重大。研究表明，Ki-67存在于细胞核内[2]，在细胞增殖过程中起着至关重要的作用，可以用来识别生长中的正常细胞和肿瘤细胞，评估细胞的增生程度。在人类肿瘤研究中，很多研究都已经证实Ki-67与乳腺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌等癌症关系密切[3-7]。而Ki-67在犬乳腺肿瘤的表达情况报道较少，因此，我们研究了Ki-67在中国农业大学所收集的北京市135例犬乳腺肿瘤的表达情况，将对犬乳腺肿瘤的早期诊断、预后判断及治疗方面具有重要的指导意义。