化痰通瘀解毒方提取物对人胃癌细胞SGC-7901侵袭转移能力的影响

方海雁，刘　蕾，施　慧，黄金玲，洪星辉

(1.安徽中医药大学科技处，安徽 合肥　230012；2.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥　230038；3.安徽中医药大学中西医结合研究所，安徽 合肥　230038)

化痰通瘀解毒方提取物对人胃癌细胞SGC-7901侵袭转移能力的影响

方海雁1，刘蕾2，施慧2，黄金玲3，洪星辉3

(1.安徽中医药大学科技处，安徽 合肥230012；2.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥230038；3.安徽中医药大学中西医结合研究所，安徽 合肥230038)

[摘要]目的观察化痰通瘀解毒方提取物对人胃癌细胞株SGC-7901侵袭转移能力的影响。方法10、20、40 μg/mL化痰通瘀解毒方提取物分别干预人胃癌细胞SGC-7901 24 h后，采用Transwell小室法检测人胃癌细胞SGC-7901的侵袭、迁移能力，分别采用酶联免疫吸附试验和Western blot法检测SGC-7901细胞中基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达水平。结果4组SGC-7901的侵袭细胞数和迁移细胞数以及E-cadherin和MMP-9表达水平比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)，呈现明显的剂量依赖性，以高剂量化痰解毒方提取物的效应最明显。结论化痰解毒方可抑制人胃癌细胞SGC-7901侵袭和迁移能力，其作用机制可能与上调E-cadherin表达，下调MMP-9的表达有关。

[关键词]化痰通瘀解毒方；胃癌细胞；SGC-7901；侵袭；转移；E-钙黏蛋白；基质金属蛋白酶9

胃癌是临床常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均居于恶性肿瘤的第3位[1]。胃癌细胞的浸润、侵袭和转移是导致胃癌进展及术后复发的主要原因[2]。既往研究[3-4]发现，化痰通瘀解毒方(Huatan-Tongyu-Jiedu Decoction，HTJD)能有效抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖和移植瘤小鼠微血管的生成。本实验在前期研究的基础上，拟观察HTJD提取物对人胃癌细胞SGC-7901侵袭、转移能力的影响，并探讨其可能的作用机制。

1材料

1.1药物HTJD(半夏、瓜蒌、黄连、白花蛇舌草、酒大黄、三七、壁虎、薏苡仁、茯苓、人参等)所有中药饮片均购自安徽济仁药业有限公司，经安徽中医药大学药学院中药鉴定教研室鉴定。采用正交试验法优选HTJD的最佳水提工艺，即加10倍量水，提取3次，每次45 min，合并滤液，减压浓缩，得HTJD水提物。取HTJD水提物适量，75%乙醇醇沉，静置过夜，取上清液，沉淀物用75%乙醇洗净，与之合并，减压浓缩，移放冷处，静置一定时间，待沉淀完全，滤过，滤液置旋转蒸发仪低温蒸发，得干燥粉末。称取HTJD提取物干燥粉末，用DMEM培养液溶解、稀释，配制所需浓度药液，调整酸碱度至pH 7.4，微孔滤膜(0.22 μm)滤过，分装，4 ℃保存备用。测定药物干预最大浓度(40 μg/mL)，悬液渗透压为304 mOsmol/kg。

1.2细胞人胃癌细胞SGC-7901购自中国科学院上海生命科学研究所。

1.3试剂Transwell小室：孔径8.0 μm, 美国Millipore公司；Matrigel胶：美国BD公司；基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9， MMP-9)ELISA检测试剂盒：上海生工生物工程有限公司；兔抗人E-cadhein抗体：英国Abcam公司；DMEM细胞培养液：美国HyClone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)：浙江省杭州四季青公司；HRP结合的IgG二抗：美国Bioworld公司。

1.4设备Forma 370细胞培养箱：美国Thermo公司；纯水-超纯水净化器：美国millipore公司；PowerPac系列电泳仪：美国Bio-Rad公司；FCM凝胶成像仪：美国protein simple公司；Olympus IX51倒置荧光显微镜：日本Olympus公司；ATOM酶联免疫分析系统：意大利Maroche公司；Centrifuge 5430R超低速离心机：德国Eppendorf公司；人工基底膜Matrigel胶：美国BD公司。

2方法

2.1Transwell小室检测HTJD提取物对胃癌细胞侵袭能力的影响无血清培养液稀释Matrigel胶至5 mg/mL，取100 μL稀释胶加至带有8 μm孔径聚碳酸酯膜的Transwell小室内，37 ℃孵育1 h。取对数生长期细胞SGC-7901，分别加入10、20、40 μg/mL HTJD提取物作用24 h，胰酶消化处理，调整细胞浓度至1.0×106/mL，各组吸取200 μL接种于Transwell小室内，同时下室加入600 μL含10% FBS完全培养液。每组设置3个复孔。37 ℃、5% CO2培养24 h后，取出Transwell小室，弃上室余液，PBS清洗3次，用棉签擦去上室未侵袭细胞和Matrigel胶，取下微孔滤膜，用0.1%结晶紫细胞染色。在倒置荧光显微镜(10×20倍)下观察，每组随机选取5个不同视野的穿膜细胞计数，实验重复3次，取平均值。细胞侵袭抑制率=(1-实验组穿膜细胞数/对照组穿膜细胞数)×100%。

2.2Transwell小室检测HTJD对胃癌细胞迁移能力的影响采用“2.1”项下Transwell小室法，省略在8.0 μm孔径聚碳酸酯膜铺Matrigel胶步骤，其余实验步骤与“2.1”相同。细胞迁移抑制率=(1-实验组穿膜细胞数/对照组穿膜细胞数)×100%。

2.3Western blot检测人胃癌细胞SGC-7901 E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平取对数生长期细胞SGC-7901，接种于6孔板中，分别加入含不同浓度(0、10、20、40 μg/mL)HTJD提取物培养液，继续培养24 h后，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取20 μg总蛋白上样于10% SDS-PAGE中电泳，分离蛋白质，槽式湿转法转移蛋白质到PVDF膜，加入1∶1 000稀释的E-cadherin一抗，4 ℃孵育12 h，加入合适稀释度的HRP标记的二抗，室温孵育2 h，TBST摇洗3次，每次5 min。曝光后，采用Image J软件进行分析。

2.4ELISA检测人胃癌细胞SGC-7901中MMP-9表达水平取对数生长期SGC-7901细胞，接种至24孔板中，分别加入含不同浓度(0、10、20、40 μg/mL)的HTJD提取物培养液，继续细胞培养24 h，每组设3个复孔。取细胞上清液，按ELISA试剂盒说明书进行操作，在480 nm处测量各孔OD值。

3结果

3.1HTJD提取物对人胃癌细胞SGC-7901侵袭能力和迁移能力的影响 4组穿膜侵入Transwell下室的SGC-7901细胞数量和穿过8.0 μm孔径聚碳酸酯膜迁移至Transwell下室的细胞数量比较，差异均具有统计学意义(侵袭细胞数：F(3，8)=81.57，P=0.000；迁移细胞数：F(3，8)=596.46，P=0.000)。随着剂量增加，HTJD提取物对SGC-7901细胞的侵袭能力和迁移能力的抑制作用越强，具有明显的剂量依赖性。结果见表1和图1。

表1　HTJD提取物对人胃癌细胞SGC-7901侵袭转移能力的影响±s)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与HTJD提取物10 μg/mL组比较，#P<0.05；与HTJD提取物20 μg/mL组比较，△P<0.05。

注：A.空白对照组；B. HTJD提取物10 μg/mL组；C. HTJD提取物20 μg/mL组；D. HTJD提取物40 μg/mL组；图中白色箭头示SGC-7901细胞，黑色箭头示8.0 μm聚碳酸酯膜孔径。

图1HTJD提取物对胃癌细胞SGC-7901侵袭能力的影响(倒置显微镜下观察，结晶紫染色，10×20倍)

3.2HTJD提取物对胃癌SGC-7901细胞中E-cadherin和MMP-9表达水平的影响4组E-cadherin和MMP-9表达水平比较，差异均具有统计学意义(E-cadherin：F(3，8)=39.83，P=0.000；MMP-9：F(3，8)=92.54，P=0.000)。随着剂量增加，HTJD提取物促进胃癌细胞SGC-7901表达E-cadherin的作用和抑制胃癌细胞SGC-7901表达MMP-9的作用越明显，具有明显的剂量依赖性。结果见图2。

4讨论

侵袭转移是恶性肿瘤最基本的生物学特性之一，直接影响临床疗效和预后，也是危及患者生命的主要原因[5]。肿瘤的侵袭转移是个复杂有序的过程，大致可分为脱落、黏附、降解基质和移动4个过程，阻断其中的任一环节，均有可能抑制肿瘤的侵袭转移。本实验采用Transwell小室法检测HTJD提取物对胃癌细胞侵袭和迁移能力的影响，结果显示，

注:A为空白对照组;B、C、D分别为HTJD提取物10、20、40μg/mL组;与空白对照组比较,*P<0.05;与HTJD提取物10μg/mL组比较,#P<0.05;与HTJD提取物20μg/mL组比较,△P<0.05。

图2HTJD提取物对胃癌SGC-7901细胞中E-cadherin和MMP-9表达水平的影响(n=3)

HTJD提取物各剂量(10、20、40 μg/mL)干预胃癌细胞24 h后，细胞的侵袭和迁移抑制率均增高，差异有统计学意义(P<0.05)，且抑制效应呈剂量依赖关系。提示HTJD提取物可抑制人胃癌细胞SGC-7901的侵袭和转移，是其抗癌作用机制之一。

在肿瘤侵袭转移的过程中，许多细胞黏附分子和蛋白水解酶参与调控。E-cadherin是一种具有黏附特性的跨膜糖蛋白，广泛存在于各类上皮细胞中，与其细胞内的相关蛋白——连环素形成复合体后，介导同种细胞间的黏附反应，从而抑制肿瘤细胞脱离原发灶。E-cadherin表达下调或不表达使上皮细胞离散，癌细胞易于脱落，具有较强的侵袭能力，且E-cadherin蛋白的表达与胃癌的分化程度、淋巴结转移及远处转移的发生也有密切的关系[6-7]。

细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的降解是浸润和转移的早期信号[8]，这一过程需要降解酶系的参与，其中MMPs是最重要的一类。MMPs是一类含Zn2+依赖性蛋白酶，其主要功能是降解ECM成分。黏附后的癌细胞通过自身分泌或诱导产生MMPs，局部降解ECM，肿瘤细胞沿着缺失的ECM向周围组织浸润，导致肿瘤的侵袭和转移。MMP-9是MMPs家族中分子量最大的酶，主要功能是降解破坏ECM中最主要的组分Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶。有研究[9-10]证实，抑制MMP-9基因表达可在一定程度上达到抑制肿瘤侵袭转移的目的。

综上，E-cadherin和MMP-9蛋白的表达高低与胃癌侵袭和转移密切相关，成为胃癌治疗和降低转移复发的新的治疗靶点。

本实验借助Western blot和ELISA技术，对E-cadherin和MMP-9蛋白表达水平进行检测，观察到HTJD提取物呈剂量依赖性地升高E-cadherin表达水平和降低MMP-9表达水平。

中医学认为，肿瘤的发生乃外受邪毒，内伤七情，脏腑失调，阴阳失衡，痰凝瘀阻毒蕴而成。癌毒痰瘀胶结、深伏盘踞是其基本病机。因此，活血化瘀、化痰散结是肿瘤治疗及防治复发、转移的重要方法。HTJD由半夏、瓜蒌、黄连、白花蛇舌草、酒大黄、三七、壁虎、薏苡仁、茯苓、人参等组成，具辛开苦降、清热涤痰、解毒开结、逐邪护正之功。本实验研究结果显示，该方提取物能有效抑制人胃癌细胞SGC-7901的侵袭和转移，且作用机制可能与下调MMP-9的表达，上调E-cadherin表达有关。本实验为HTJD的抗癌作用提供了新的研究方向，但进一步的研究尚需结合体内及临床实验来明确其应用前景。

参考文献：

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Effect of Extract of Huatan-Tongyu-Jiedu Decoction on Invasion and Migration of Human Gastric Carcinoma Cell Line SGC-7901

FANGHai-yan1,LIULei2,SHIHui2,HUANGJin-ling3,HONGXing-hui3

(1.DepartmentofScienceandTechnology,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.GraduateCollege,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 3.InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of extract of Huatan-Tongyu-Jiedu Decoction (HTJD) for dispelling phlegm, resolving stasis, and detoxicating on the invasion and migration of human gastric carcinoma cell line SGC-7901. MethodsHuman gastric carcinoma SGC-7901 cells were treated with 10, 20, or 40 μg/mL extract of HTJD for 24 h. The invasion and migration of SGC-7901 cells were evaluated by Transwell chamber assay. The expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and E-cadherin in SGC-7901 cells was determined by enzyme-linked immunosorbent assay and Western blot. ResultsThe four groups showed significant differences in the number of invading and migrating SGC-7901 cells, as well as in the expression of E-cadherin and MMP-9 (all P<0.05). HTJD extract had a dose-dependent effect on the invasion and migration of SGC-7901 cells, greatest at the highest dose. ConclusionHTJD can inhibit the invasion and migration of human gastric carcinoma SGC-7901 cells, and the mechanism may be related to the up-regulation of E-cadherin expression and down-regulation of MMP-9 expression.

[Key words]Huatan-Tongyu-Jiedu Decoction; Gastric carcinoma cell; SGC-7901; Invasion; Migration; E-cadherin; Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)

基金项目：国家自然科学基金项目(81173171，81573864)；安徽高校自然科学研究重点项目(KJ2016A393)

作者简介：方海雁(1984-)，女，硕士，讲师

通信作者：黄金玲，jinling6181@126.com

[中图分类号]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.03.022

(收稿日期：2016-03-05；编辑：姚实林)