电针对ApoE-/-小鼠肝脏PPARα与TNF-α蛋白表达的影响

孙　蕊，詹冬梅 ，艾炳蔚

(1.南京中医药大学第二临床医学院，江苏 南京　210023；2.盐城市第三人民医院，江苏 盐城　224005；3.南京中医药大学附属医院，江苏 南京　210029)

电针对ApoE-/-小鼠肝脏PPARα与TNF-α蛋白表达的影响

孙蕊1，詹冬梅2，艾炳蔚3

(1.南京中医药大学第二临床医学院，江苏 南京210023；2.盐城市第三人民医院，江苏 盐城224005；3.南京中医药大学附属医院，江苏 南京210029)

[摘要]目的探讨电针对载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠肝脏过氧化物酶体增殖剂激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)蛋白表达的影响。方法将30只ApoE-/-小鼠随机分为模型组、药物组及电针组，每组10只。采用高脂饲料喂养14周的方法复制高脂血症模型。电针组小鼠接受单侧神门、内关、足三里、三阴交电针，药物组小鼠每日接受40 mg/kg辛伐他汀灌胃。免疫组织化学法检测肝脏中PPARα、TNF-α的表达，采用Western blot检测肝脏PPARα的蛋白表达。结果电针组小鼠肝脏中PPARα的蛋白表达水平高于模型组，但差异无统计学意义(P>0.05)，肝脏TNF-α表达水平显著低于模型组(P<0.05)。与模型组比较，电针组小鼠肝细胞内小颗粒脂滴减少，肝细胞凋亡和坏死减少，且肝细胞保存相对完整。结论电针通过抑制炎性因子的表达而减少脂质沉积，治疗动脉硬化。

[关键词]动脉粥样硬化；高脂血症；电针；PPARα；TNF-α

动脉硬化(atherosclerosis，AS)已严重危害人类健康，是心脑血管病的病理基础。AS的发展过程非常复杂，其发生与动脉内膜的损伤、脂质浸润、单核细胞的侵入、平滑肌细胞的增殖和迁移、斑块的破裂、血管的堵塞以及微循环障碍等因素有关。现代研究证实，电针疗法对AS的发生发展具有防治作用[1]。电针疗法作用途径多样，具有调节脂质代谢，改善血流动力学，抑制炎症等作用[2-3]。

本次实验采用动物模型为载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠。相关研究[4]证实，ApoE-/-小鼠由于对富含胆固醇的脂蛋白清除障碍，导致总胆固醇、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白水平升高，这种小鼠无论是正常饮食还是高脂饮食均可形成严重高脂血症，并自发形成AS斑块，其斑块的分布及病理特征与人类AS斑块的分布均十分相似，目前是国内外公认的研究AS较好的动物模型。

1材料

1.1实验动物38只6周龄、健康的ApoE-/-雄性小鼠，平均体质量为22.1 g，饲养于南京大学模式动物研究所实验动物房屏障环境内。小鼠生产许可证号为SCXK(苏)2010-0001，动物房合格证号为SYXK(苏)2010-0003，由江苏省协同医药生物工程有限公司提供小鼠清洁级饲料，饲料的合格证号是苏饲审(2008)01008；饲养环境温度22～24 ℃，相对湿度50%～70%，光照时间8:00—20:00。

1.2主要仪器辛伐他汀胶囊(商品名：舒降之)，每片20 mg，杭州默沙东制药有限公司生产；韩氏穴位神经刺激治疗仪200E；中研太和针灸针(直径0.16 mm，长7 mm)；针灸治疗固定器；DSCN 3852电子秤；上海宝赛离心机Microcl-17；华东电子DG5033A酶标仪；上海跃进电热恒温干燥箱；徕卡EG1150石蜡包埋机；徕卡RM2235石蜡切片机；奥林巴斯病理切片扫描系统；国华HH-4数显恒温水浴锅。

1.3主要试剂肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、过氧化物酶体增殖剂激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα)、兔抗鼠一抗：均购自英国Abcam公司。

2方法

2.1治疗方法模型复制期间，给予小鼠喂食高脂高胆固醇饮食(含21%脂肪、1.25%胆固醇)，14周持续喂养，随机选择3只小鼠处死，通过观察主动脉窦苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色结果来确认高脂血症模型是否复制成功。ApoE-/-小鼠高脂血症模型复制成功后，治疗11周。模型组：每日灌胃蒸馏水10 mL/kg；针灸治疗固定器上隔日固定10 min。药物组：辛伐他丁每日40 mg/kg，10 mL/kg灌胃，每日灌胃1次；针灸治疗固定器上隔日固定10 min。电针组：电针针刺小鼠“内关”“神门”“后三里”“三阴交”，电针采用疏密波，频率为2/15 Hz，电流输出大小为0.3 mA，针刺时间为10 min，每次电针单侧，交换进行，隔日治疗1次；每日灌胃蒸馏水10 mL/kg。以上针刺穴位按《实验针灸学》[5]定位标准治疗。

2.2组织取材小鼠在11周治疗结束后，分别在禁食12 h后打开胸腹腔，取主动脉和肝脏后，将主动脉和部分肝脏用石蜡包埋。随机在包埋主动脉窦的石蜡包块中选择2个相距50 μm的观测点，应用徕卡RM2235石蜡切片机连续5张切片，厚度6 μm；肝脏石蜡包块连续切片，厚度6 μm。各组小鼠主动脉窦石蜡切片，行HE染色，400倍光镜下观察主动脉窦的斑块形态结构。肝脏石蜡切片用于检测TNF-α、PPARα的表达水平。

2.3实验指标检测方法

2.3.1免疫组织化学法检测TNF-α、PPARα表达水平将肝组织石蜡切片放置在恒温箱中烘烤后，置于不同浓度的二甲苯、乙醇浸泡，3% H2O2去离子水孵育，蒸馏水冲洗后用PBS浸泡；蒸锅抗原修复，自然冷却后，用山羊血清封闭液封闭；滴加适当比例一抗，4 ℃过夜后滴加二抗，室温下孵育后用PBS浸洗；滴加1∶100链霉素卵白素，室温下孵育；DAB显色后，苏木精复染，蒸馏水浸洗，梯度脱水，透明，封片，光镜下检测，以肝腺泡3区内单位视野(80 μm×80 μm)下表达PPARα和TNF-α蛋白的肝细胞数作为PPARα和TNF-α的表达水平。

2.3.2Western blot法检测肝脏PPARα的相对表达水平肝组织总蛋白提取后，将组织蛋白定量，在SDS-PAGE中电泳，化学发光、显影、定影，测定光密度值，计算PPARα蛋白的相对表达水平。

3结果

3.13组ApoE-/-小鼠主动脉窦形态学变化模型组与药物组主动脉窦内膜下出现斑块，且斑块中有明显增厚脂质沉积，并见大量坏死核、大量胆固醇结晶体以及脂核和斑块钙化区；纤维帽较薄弱，斑块不稳定。电针组内膜下也出现斑块，并见大量泡沫细胞，及较少量胆固醇结晶体、钙化，且纤维帽较厚。见图1。结果提示电针可减少胆固醇沉积，稳定斑块，减缓AS进程。

注:A.模型组;B.药物组;C.电针组。图1 3组ApoE-/-小鼠主动脉窦形态学变化(10×40倍,HE染色)

3.2免疫组织化学法检测的3组ApoE-/-小鼠肝脏PPARα、TNF-α蛋白表达水平比较阳性染色的PPARα和TNF-α蛋白为浅黄色、棕黄色或棕褐色颗粒。模型组肝腺泡3区肝细胞核免疫组织化学法染色后呈现淡蓝色、大而圆，部分细胞出现双核和多倍体核；肝细胞内出现脂肪变性，肝细胞内出现大颗粒脂滴，细胞核被挤压和移位；同时有大量肝细胞的凋亡和坏死。药物组小鼠肝细胞内脂滴分布密集，颗粒较大。电针组肝腺泡3区肝细胞核免疫组织化学染色后呈现淡蓝色，部分肝细胞内出现小颗粒脂滴，未有大量肝细胞的凋亡和坏死，且肝细胞保存相对完整。见图2和图3。3组PPARα蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(Kruskal-Wallis检验，χ2=5.71，P=0.058)，但针刺组PPARα蛋白表达水平较模型组和药物组呈现增多趋势。3组TNF-α蛋白表达水平比较，差异具有统计学意义(F(2，27)=4.76，P=0.017)，电针组TNF-α表达水平显著低于模型组(P<0.05)。见表1。

注:A.模型组;B.药物组;C.电针组。图2 3组ApoE-/-小鼠肝腺泡3区内PPARα蛋白表达水平比较(10×40倍,免疫组织化学染色)

注:A.模型组;B.药物组;C.电针组。图3 3组ApoE-/-小鼠肝腺泡3区内TNF-α蛋白表达水平比较(10×40倍,免疫组织化学染色)

表1　3组小鼠肝腺泡3区内PPARα和

注：与模型组比较，*P<0.05。

3.3Western blot法检测的3组ApoE-/-小鼠肝脏PPARα相对表达水平比较模型组(n=3)、药物组(n=3)和电针组(n=3)PPARα的相对表达水平分别为(17.15±5.69)、(23.67±5.73)和(22.43±8.70)。3组PPARα相对表达水平比较，差异无统计学意义(F(2，6)=0.766，P=0.505)，电针组和药物组PPARα相对表达水平较模型组有升高趋势。见图4。

图4　3组ApoE-/-小鼠肝脏PPARα

4讨论

4.1电针调节脂质代谢在AS过程中，血脂异常是影响其发生发展的风险因素，PPARα对血脂具有良性的调节作用。在临床试验中，PPARα的贝特类可以降低血浆三酰甘油水平，提高高密度脂蛋白胆固醇的水平。有研究[6]表明，经非诺贝特治疗后，冠状动脉疾病患者体内apoA-Ⅱ含量显著增加，且PPARα的其他一些激动剂也可诱导人体apoA-Ⅱ的表达。apoA-Ⅰ与apoA-Ⅱ是高密度脂蛋白的重要组成部分，此外，也是参与胆固醇逆转录的重要调节因子，因此PPARα不仅可以调节高密度脂蛋白的水平，还间接影响胆固醇的逆转录。从本次研究结果来看，电针提高ApoE-/-小鼠肝脏表达PPARα的作用虽无统计学意义，但是与其他两组相比具有上升趋势。且从肝脏的病理切片观察来说，针刺组较模型组与药物组小鼠肝细胞保存完整，脂滴数量较少。而其他两组，尤其是模型组，肝细胞出现双核和多倍体核；肝细胞内出现脂肪变性，有大颗粒脂滴，细胞核被挤压和移位；同时有大量肝细胞的凋亡和坏死。提示电针治疗有利于提高PPARα的表达，其效应无统计学意义，这可能与疗程短和针刺的刺激量不够有关，需要进一步的实验来证实。

4.2电针抑制炎症炎症在脂质代谢的失衡中发挥重要作用，炎症促进细胞对脂质的摄取和蓄积，脂质代谢的失衡也是细胞对炎症的反应。有研究[7]表明，针灸可抑制炎症的进展。PPARα具有抑制炎症的作用，PPARα通过抑制核因子κB和活性蛋白-1信号转导通路及调节cAMP应答元件结合蛋白-H而实现抗炎作用。TNF-α是一种炎性因子，是促使AS发生发展的促炎性因子。血管内皮损伤为AS形成的始动环节。有研究[8]证实，TNF-α对于血管内皮的损伤具有促进作用；同时，TNF-α可促进平滑肌细胞增殖及平滑肌源性泡沫细胞形成，而平滑肌细胞增殖及向内膜下迁移是AS的主要病理特征之一。胡启程等[9]研究表明，TNF-α破坏血管表面凝血与抗凝血平衡，促进血栓形成；TNF-α还可增加基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)、MMP-9的表达，而MMP-2、MMP-9可降解细胞外基质成分，导致斑块的不稳定性增加，从而增加心脑血管病的风险。 本次研究表明，电针对炎症有明显的抑制作用。故此可推测，电针对炎症的抑制作用可能是通过上调PPARα而间接抑制炎症通道的转录，即抑制炎症发展的上游。同时，在炎症因子发展中，也可对炎性因子有直接的抑制作用。电针可能作用于炎症发展的各个过程，但是否还有其他因子的参与，以及对炎症起直接作用还是间接作用，这些均需要进一步研究。

4.3穴位的选择内关穴是治疗胸痹的首选穴，是心包经络穴，可通窍醒神、通血脉、行气血，针刺内关可实现对心脏、血脉的调节作用。有研究[10]发现，针刺内关可增强心脏收缩，提高心输出量，降低心肌耗氧，改善冠状动脉循环，增加心肌血氧供给。神门穴是手少阴之俞，为原穴，有扶正祛邪、宁心安神的作用。内关、神门合用，可起到降低血液黏稠度，抑制血小板聚集，降低血脂的作用[11]。补足三里能健脾，泻足三里能平肝，针刺该穴有和胃健脾、通腑化痰、升降气机的作用。三阴交为脾、肾、肝三经交会之穴，刺之可健脾胃、益精气、促运化、升清降浊、除湿祛痰。有研究[12]证实，针灸三阴交和足三里，可增强胆固醇的分解和排泄，减少其合成和吸收，改变其在血浆和组织中的分布，从而降低血液中胆固醇含量。四穴合刺，标本兼治，可达活血化瘀、调和气血、通腑泄浊、健脾利湿的作用，从而提高抗氧化能力和保护血管内皮能力，以改善动脉粥样硬化。

综上所述，电针疗法通过调节脂代谢、抑制炎症等作用，有效抑制AS的发生发展。大量研究证实，针刺治疗AS属于整体疗法，多靶点、多途径作用于人体，通过发挥特异性和非特异性两方面的效应，达到治疗、预防AS的目的。

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Effect of Electroacupuncture on Protein Expression of PPARα and TNF-α in Liver of ApoE-/-Mice

SUNRui1,ZHANDong-mei2,AIBing-wei3

(1.SecondSchoolofClinicalMedicine,NanjingUniversityofChineseMedicine,JiangsuNanjing210023,China; 2.TheThirdPeople’sHospitalofYancheng,JiangsuYancheng224005,China; 3.TheAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,JiangsuNanjing210029,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture on the protein expression of peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARα) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in the liver of ApoE-/-mice. MethodsA total of 30 ApoE-/-mice were randomly divided into model group, drug group, and electroacupuncture group, with 10 mice in each group. The model of hyperlipidemia was established by high-fat drink for 14 weeks. The mice in the electroacupuncture group were given electroacupuncture at Shenmen, Neiguan, Zusanli, and Sanyinjiao points, and those in the drug group were given simvastatin 40 mg/kg per day by gavage. Immunohistochemistry was used to measure the expression of PPARα and TNF-α in the liver, and Western blot was used to measure the protein expression of PPARα in the liver. ResultsCompared with the model group, the electroacupuncture group showed nonsignificantly higher protein expression of PPARα in the liver (P>0.05) and significantly lower expression of TNF-α in the liver (P<0.05). Compared with the model group, the electroacupuncture group had decreased small lipid droplets in the liver, reduced hepatocyte apoptosis and necrosis, and relatively complete hepatocytes. ConclusionElectroacupuncture can reduce liquid deposition through inhibiting the expression of inflammatory factors, so as to treat arteriosclerosis.

[Key words]Atherosclerosis; Hyperlipidemia; Electroacupuncture; Peroxisome proliferator-activated receptor alpha; Tumor necrosis factor alpha

基金项目：江苏省“六大人才高峰”资助项目(2011-WS047)

作者简介：孙蕊(1990-)，女，硕士研究生

通信作者：艾炳蔚，aibingwei@163.com

[中图分类号]R541.4；R246[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.03.019

(收稿日期：2016-02-21；编辑：姚实林)