ATP合酶的研究进展

柳昭明，冯 红

(天津体育学院 天津300381)

ATP合酶的研究进展

柳昭明，冯 红*

(天津体育学院 天津300381)

ATP合酶又称F0F1-ATP酶，是一个多亚基复合体，广泛存在于生物界，包括细菌的质膜、线粒体内膜和类囊体膜，可以催化能源物质ATP的合成。这种酶在生物能学、生物化学、物理学和纳米学领域受到重要关注。ATP合酶主要由两部分组成：一是水溶性的蛋白复合体F1，另外一个是疏水部分F0，两者都是转动马达。其中F1亚基由核基因编码，F0亚基由线粒体ATP6和ATP8基因以及核基因共同编码。该酶利用线粒体内膜两侧质子梯度差形成的势能，通过结合改变机理旋转合成ATP，也可逆水解ATP形成梯度差，达到了很高的能量转化效率。研究其对于能量代谢具有重要价值，国内外学者一直在对其进行探索。综合国内外文献对ATP合酶的功能、结构、研究历史和影响因素进行了阐述。

ATP合酶 功能 结构 历史 影响因素

0 引 言

三磷酸腺苷(ATP)是细胞的能量货币。人体ATP含量通过水解与合成的动态平衡保持在50,g左右。人体1天基础代谢条件下产生50～75,kg ATP，用于各种耗能反应。在有氧情况下，ATP合成的主要途径是氧化磷酸化，而氧化磷酸化的末端反应是F0F1-ATP合酶催化的。

如图1所示，电子通过辅酶Q、细胞色素bc1复合体和细胞色素c从NADH脱氢酶转移到细胞色素c氧化酶。建立的质子梯度穿过线粒体内膜驱动ATP合酶里的质子流并伴随ATP合成。ATP合酶通过质子跨膜的电化学势催化二磷酸腺苷(ADP)和无机磷酸盐(Pi)合成ATP，也就是说，它将电化学势转化为化学形态。相反，当电化学势不足的时候，它催化质子泵形成电化学势水解ATP产生ADP和Pi。

图1 呼吸链和ATP合酶Fig.1 The respiratory chain and ATP synthase

1 历 史

ATP合酶的分子学研究始于1960年，Efraim Racker和他的同事报道了牛心线粒体中可溶因子的离析。这种F1因子有ATP水解功能，还具有使失去ATP合成功能的膜碎片恢复ATP的合成能力。[1]Efraim等人还从叶绿体中离析出相似的因子，其显示在线粒体和叶绿体ATP合酶的基本特征是一样的。在此之后，在ATP合酶的研究上至少出现了两场著名的革命。[2]

1961年，Peter Mitchell(1978年诺贝尔奖获得者)提出了化学渗透假说，声明以前寻找的一种能将氧化呼吸原料和ATP合成联系起来的高能化学中间体的观念是错误的。他提出质子跨膜的电化学势ΔμH+假说，于是，假定的ATP合酶被预测为一种具有质子转移功能的ATP合成酶或水解酶。这种假说不被当时的生化学家所接受。[3]1966年，Andre Jagendorf的“酸-碱转换”实验改变了这种形势。他在叶绿体膜两侧加酸碱梯度并观察无光条件下的ATP合酶。化学渗透机制最终由Yasuo Kagawa通过囊泡重建方法确立：在人为施加电化学势的驱动下，含有纯净ATP合酶的囊泡催化了ATP的合成。[4]

发现ATP合酶在F0内质子流与F1内ATP合成/水解两者间的能量交换中的作用则是另一次变革。1997年，Paul Boyer(1997年诺贝尔奖获得者)提出构象变化假说。氧化所释放的能量可能通过ATP合酶的3种具有催化功能的β亚基的构象变化合成ATP。3种β亚基根据与核苷酸的亲和力不同，依次发挥作用。每个β亚基具有松弛状态(1oose)、紧密结合状态(tight)和无底物与之结合状态(open)，且3个β亚基的构象总是互不相同，每个β催化亚基经过几次伴随构象改变而发生结合变化，最后形成1个ATP分子。该过程反复进行以不断合成ATP。这种由于亲和力的改变而不是ATP合成或水解的化学转化，且伴随着能量的输入或输出的构象变化假说后来也被称为“结合变构机理”(binding change mechanism)。Boyer随后假设造成这种顺序改变的原因是γ亚基中心的物理旋转。[5]

1996年，Junge等还提出了一个旋转催化的模型。这个旋转运动假设的实质就是c亚基圆环的周围是必不可少的羧基。部分c亚基的外部环形表面与a亚基相互作用，在羧基部位是负电荷。假设a亚基在线粒体内膜外侧表面有1个进口，允许1个质子中和羧基的1个负电荷。这样使未电离的羧基利用热震动寻求与磷脂双分子层接触的环境。羧基在圆周某一点的中和伴随c亚基环周围其他羧基的进一步重新电离。在内膜内侧a亚基出口点上进行质子的释放，并在c亚基环与a分界处使负电荷再生。这些加速质子或减速质子会促成c亚基环产生旋转移动，使另一个负电荷移向入口点与另一个质子中和，其他质子在出口点的释放产生了进一步的旋转。这个旋转的设想就是直接与γ亚基结合。每个ATP的合成都要求γ亚基旋转 120 °，因此γ亚基完成1次旋转将产生3个ATP分子。在质子运动的假设中，c亚基环包含12个c亚基，这与质子中和4个羧基的假设相符。另外，在F0部分中，如果ATP与H+的比值是4，那么它应与12个c亚基相对应；同样，如果ATP与H+的比值是3，在F0部分中就要求有9个c亚基。[6]

虽然ATP合酶这种不寻常的协同动力学支持了构象改变学说，但随后很少有人去研究它。10年后，John Walker和他的同事展示了牛心的结构。但是对于Boyer假说提供最有力支持的还是日本Noji的实验。Noji等对于F1-ATP酶在催化ATP水解时的F1结构进行了分析，证明了Boyer的假设。[7]Noji等的实验设计基于Walker对牛心线粒体Fl-ATP酶的晶体结构分析，实验结果直观呈现了在水解ATP过程中γ亚基是在α3β3形成的圆筒式结构中转动的，这是对Boyer提出的转动催化假说最有力的支持。[8]

2 结 构

F0F1-ATP合酶分子量＞500,kDa，由两个旋转马达组成，其中一个是F1(≈380,kDa)，是ATP合酶水溶性部分。当被膜隔离的时候，它作为受ATP驱动的马达，旋转内部亚基水解ATP，因此被称为F1-ATP酶。ATP合酶的另一个旋转马达是F0(≈120,kDa)，它嵌入膜内，受质子电化学势驱动，通过质子转移产生旋转扭矩。[9]

细菌的F1由α3、β3、γ、δ和ε亚基组成。3种α亚基和3种β亚基交替排列，组成六聚环状定子。转轴是γ 亚基，它被容纳在α3β3环的中央腔内。ε 亚基与γ亚基突出的部分结合为F1与F0之间提供了连接。ε亚基是F1内源性抑制器，它通过改变构象从关闭状态变为开放状态造成了位阻现象从而封锁了γ亚基。[10]这种抑制功能被认为是生理上抑制ATP消耗的重要功能。

δ亚基作为F1和F0之间的连接者，负责连接定子部分。因此，F1最小的分子马达复合体是α3β3γ子复合体。ATP水解或合成的催化中心就在α-β界面，它在β亚基的逆时针方向一侧。没有ATP催化功能的部分位于α-β界面另一侧。起催化作用的部分主要由β亚基的氨基酸残基形成，非催化部分主要在α亚基里。当ATP水解的时候，从F0一面的方向看，F1的γ亚基逆时针方向旋转。[11]

F0部分由a、b2、c10-15等3种亚基组成。不同物种之间的c亚基数量不同。例如，在牛心线粒体是8个，酵母菌、大肠杆菌和嗜热杆菌PS3里是10个，产丙酸菌和梭状芽胞杆菌里是11个，噬碱芽孢杆菌OF4里13个，菠菜叶绿体里14个，钝顶螺旋藻里15个。[12]

ATP6和ATP8是编码部分F0亚基的线粒体基因。所有生物都具有ATP6基因，但是细菌、植物的线粒体基因组不包含ATP8基因，这与一般后生动物有所不同。在人的线粒体基因中，ATP6与ATP8相邻并重叠45,bp，ATP8基因长207,bp，编码68个氨基酸，ATP6基因长681,bp，编码226个氨基酸。[13]

c亚基围成圈，形成一个环形复合体。普遍认为这个环形复合体和α亚基形成一个质子通道。当下坡质子流通过质子通道时，C-环与F1的β亚基相反的方向旋转。[14]因此，在F0F1复合体里，F0、F1推动彼此向相反的方向旋转。当质子电化学势大到超过ATP水解的自由能时，F0使γ亚基沿顺时针方向旋转，这时ATP合成是ATP合酶的主要生理功能。相反，当电化学势很小或降低时，F1迫使F0向相反的方向旋转C-环泵质子来对抗电化学势。

为了检测c亚基的表达在ATP合酶合成中的作用，Tatiana[15]等制作了在褐色脂肪组织的特异蛋白UCP1的启动子下表达c亚基P1型的转基因小鼠，结果发现在该小鼠褐色脂肪的线粒体中，c亚基和F1亚基的其他部分蛋白质水平均明显提高。这表明在所有的高级真核生物中，c亚基的水平可能是F0F1-ATP合酶含量的决定因素。

F0和F1部分之间还有OSCP(寡霉素敏感相关蛋白)亚单位，与F6、b、d亚基构成外侧柄，外侧柄与α3β3亚基复合体以及a亚基和δ亚基组成“定子”部分。c亚基、γ 和ε 亚基组成“转子”部分。OSCP是是一种213个氨基的酸性蛋白，定位于F1顶部，与大肠杆菌的δ亚基相似，在哺乳动物中高度保守。OSCP的C端区域是松散的，包含一个β折叠，精确定位与α和β亚基的界面，还包括两个α螺旋，即H7和H8。H8形成1个3螺旋与F6的α螺旋以及b亚基一部分结合在一起。[16]OSCP可估量ATP合酶结构的完整性，当F1和F0分离的时候会导致寡霉素敏感性的ATP酶活性降低。[17]缺失或重构实验证明OSCP对于偶联质子转运和ATP合成是必不可少的。[18]酵母菌里的电子追踪实验表明了OSCP是F1F0-ATP合酶组装的最后一步，而且是独立的。降低人类细胞的OSCP水平并没有改变其他F0和F1亚基和呼吸链酶复合体的表达。[19]

3 影响ATP合酶发挥功能的因素

3.1 通过F0的亚单位影响ATP合酶功能的因素

线粒体是细胞内最易受乙醇作用而损伤的细胞器，其中线粒体DNA(mtDNA)又是细胞内乙醇相关氧化应激的主要目标。mtDNA ATP合成酶6和8的基因表达产物ATP合成酶6和8蛋白是ATP合成酶F0部分的两个组分，通过调控质子转运而调节ATP合成，决定着细胞内ATP的含量。胃粘膜丙二醛(MDA)作为氧自由基与细胞作用的产物，反映了氧自由基对细胞的损伤程度。何绍珍[20]等通过实验测得不同浓度乙醇灌胃后，胃粘膜MDA含量均较正常对照组明显升高。表明乙醇在胃内代谢可产生大量氧自由基，且氧自由基生成量与乙醇浓度呈正相关。乙醇灌胃2,h后，胃粘膜ATP合成酶6和8,mRNA表达随乙醇浓度升高而下降，且氧自由基含量越高，两种基因mRNA的表达水平越低。JA Sánchez-Alcázar等[21]发现，氧自由基使mtDNA ATP合成酶6和8转录水平下降，ATP合成酶6翻译产物ATP合成酶亚单位α减少。因此，乙醇通过代谢产生自由基使ATP合成酶6转录水平降低，进而使其翻译产物ATP合成酶α亚单位减少，影响了ATP的代谢。李生广等[22]研究乙醇作用于ATP合酶复合体时，乙醇对复合体表现为非竞争性抑制行为。这表明乙醇并未直接与反应底物竞争结合位点，但其很有可能作用于酶上的乙醇敏感部位，导致复合体中F1构象的某些改变，从而使F1上催化位点与调节位点解聚，影响了活性部位，造成ATP的水解受到抑制。

亚基6和亚基9是F0部分的亚单位。酵母菌亚基6是线粒体编码的含蛋白脂质，有5个疏水性跨膜螺旋。其中疏水螺旋4和5在不同物种间保守并与质子转移相关。亚基9是与DCCD捆绑的含蛋白脂质，当亚基6的疏水螺旋4和5以及亚基9的疏水螺旋1和2发生突变时表现出寡霉素抵抗，表明寡霉素结合位点同时包含亚基6和亚基9，抑制了质子转运。[23]在只有F1的情况下，ATP水解也会发生，但是ATP水解不再与质子转移偶联，寡霉素敏感性也会消失。这证明寡霉素抑制了F0中的质子转运，进而影响了ATP水解的最大速度。[24]

N,N-二环己基碳二亚胺(N,N-dicyclohecarbodiimide，DCCD)是F0F1-ATP合酶的一种经典抑制剂，与F0的c亚基的高度保守羰基共价结合。DCCD通过形成一种稳定的N-酰基尿素与c亚基上的、H+结合的羧基残基反应，阻断了F0与F1的偶联反应。据报道，1个F0结合1个单DCCD分子就足够抑制ATP酶活性。经DCCD修饰的c环晶体结构显示环己基部分太大，不能通过c环的质子结合口袋而暴露在疏水环境中，暗示N酰基尿素与a亚基的空间位阻关闭了c环的旋转。[25]

3.2 通过F1的亚单位影响ATP合酶功能的因素

腺苷二磷酸(MgADP)不仅是ATP合成的底物，还通过非竞争性的方式抑制ATP酶活性。这种抑制被称作“ADP抑制”。它的调节位点在F1的催化中心。芽孢杆菌PS3的α3β3γ复合体的单分子实验显示“ADP抑制”导致了由ATP驱动旋转的γ亚基发生了长时间的停顿。[26]

IF1是ATP合酶的天然抑制蛋白，它是一种含84个残基的碱性非竞争性抑制蛋白。当线粒体电化学梯度低而没有质子动势发生ATP水解时，IF1与F1的β亚单位1∶1可逆结合抑制ATP酶的活性。[27]IF1的中心区域(残基42～58)与F1的α和β亚基结合，C端区域与F0的OSCP亚基结合，这种结合使得IF1绑定在ATP合酶上。这一反应由酸碱度决定，在酸性环境下IF1以二聚体形式存在，有效抑制F1的ATP酶活性。在碱性环境下，IF1形成没有抑制作用的四聚体。这种酸碱度依赖为在解偶联或者低氧状态下保护线粒体ATP提供了一种反馈机制。当糖酵解成为细胞ATP的唯一来源时，细胞基质酸碱度降低，促进了IF1对ATP水解的抑制。[28]

3.3 通过连接柄影响ATP合酶功能的因素

ε 亚基是ATP合酶天然内源性抑制剂。在细菌和叶绿体中，ε 亚基一方面偶联F0的质子传递和F1的ATP合成与水解，另一方面还抑制ATP合酶的活性。这两种功能是分开的，ε 亚基的N端行使偶联功能，C端的α螺旋区域行使抑制ATP水解功能。ε 亚基在不同物种间的抑制作用是不一样的。[28]

BZ-423是一种1,4-苯二氮，它通过选择性杀死致病性淋巴细胞来抑制小鼠狼疮，毒性比现在的狼疮药物小。为了证实OSCP是调节BZ-423诱导的细胞凋亡的细胞内靶点，Kathryn M.Johnson等[24]通过RNA干扰实验降低OSCP水平并监测细胞对BZ-423的敏感性证实了BZ-423与OSCP的结合。将细胞暴露于BZ-423，发现细胞的线粒体中迅速产生了双原子气态氧，这种活性氧可以作为引发细胞程序性死亡的信号，从而引起细胞程序性死亡。同时发现BZ-423和线粒体ATP合酶中的OSCP相结合，从而抑制线粒体ATP合酶，即OSCP作为BZ-423结合的分子靶点，引起线粒体ATP合酶及细胞的一系列变化，进而达到治疗狼疮疾病的作用。BZ-423既抑制ATP合酶的合成活动，也抑制其水解活动。

4 结 语

如何提高能量转化率，改善机能运动水平一直是科学家们的研究目标。本文通过综合国内外研究进展，系统阐述了ATP合酶的结构与作用机制，对在分子水平上研究ATP合酶影响能量代谢具有意义。

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The Advancement of ATP Synthase

LIU Zhaoming，FENG Hong*
(Tianjin University of Sport，Tianjin 300381，China)

ATP synthase is also called F0F1-ATPase.It is a complex with several subunits and is found widely existing in the biological world，including the plasma membrane of bacteria，inner membrane of mitochondria and thylakoid membrane of chloroplasts，catalyzing the synthetic of ATP.This enzyme has attracted significant attention in a wide variety of fields from bioenergetics and biophysics to chemistry，physics and nanoscience.ATP synthase is composed of two parts：a watersoluble protein complex of F1and a hydrophobic part F0.Both are rotary motors.The F1subunit is encoded by the nuclear gene，and the F0subunit is encoded by the mitochondrial ATP6 and ATP8 genes as well as the nuclear genes.Many factors affect the function of these two parts.The enzyme uses the potential energy which is formed by the proton gradient difference between the two sides of the inner membrane of the mitochondria，and by combining the change mechanism of the rotation of the synthesis of ATP，the reversible hydrolysis of ATP gradient difference，to achieve a high energy conversion efficiency，so it is of great value to the study of energy metabolism and domestic and foreign scholars have been exploring it.This paper reviews the structure，function，research history and factors that affect its function through analyzing both domestic and foreign literatures.

ATP synthase；function；structure；history；influence factor

Q55

：A

：1006-8945(2016)05-0034-06

*

国家自然科学基金面上项目Prohibitin 1 在运动能量代谢中的作用及调控F0F1-ATP合酶机制(31470061)。

2016-04-01