艾叶多糖对小鼠免疫功能影响的研究

罗　旋，胡昌猛，沈远娟，张绍飞，罗秋林，邓都尉，白　丽，2*（.大理大学基础医学院，云南大理　67000；2.大理大学云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理　67000）



艾叶多糖对小鼠免疫功能影响的研究

罗旋1，胡昌猛1，沈远娟1，张绍飞1，罗秋林1，邓都尉1，白丽1，2*
（1.大理大学基础医学院，云南大理671000；2.大理大学云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理671000）

［摘要］目的：研究艾叶多糖对小鼠免疫功能的影响，进而探讨艾叶多糖增强小鼠免疫功能的作用机制。方法：将小鼠随机分为艾叶多糖高、低剂量组和对照组，连续灌胃10 d后，处死测定小鼠体重、脾脏及胸腺重量，计算脾指数与胸腺指数，观察小鼠免疫器官重量的变化；采用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬白假丝酵母菌试验测试艾叶多糖对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响；采用脾T淋巴细胞增殖试验测试艾叶多糖对小鼠细胞免疫的影响；采用ELISA测试艾叶多糖对小鼠抗体生成的影响。结果：艾叶多糖能够增加小鼠免疫器官重量，提高巨噬细胞吞噬功能，增加B细胞产生抗体能力及增强T淋巴细胞的增殖能力。结论：艾叶多糖具有调节小鼠免疫功能的作用，对非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均有一定的增强作用。

［关键词］艾叶多糖；小鼠；免疫功能

［DOI］10. 3969/j. issn. 1672-2345. 2016. 02. 004

艾叶（Folium Artemisiae Argyi），别名大艾叶、杜艾叶、萎蒿。为菊科植物艾的叶，具有浓烈香气。其药用历史悠久最早记载于《中医别录》。艾叶除了含有主要成分挥发油外，还含有鞣质、黄酮、甾醇、多糖、微量元素及其他有机成分等〔1〕，具有抗菌、平喘、镇咳、祛痰、利胆、抗过敏性休克等作用〔2〕。大量的药理和临床研究表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，能激活免疫细胞，提高机体的免疫功能，而对正常细胞几乎没有毒副作用〔3-4〕。但艾叶多糖对免疫功能的影响是不清楚的，本研究观察了艾叶多糖对正常小鼠免疫功能的影响，旨在探讨艾叶多糖对机体的免疫调节作用。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂生理盐水、95%乙醇、氯仿、正丁醇、台盼蓝、瑞氏染液、Hank’s液（pH 7.2～7.4）；四噻唑盐（MTT，Sigma公司产品），RPMI-l640培养基（GIBCO公司）；植物血凝素（PHA，上海疾控生物科技有限公司产品）；三联液（实验室配制）；磷酸盐缓冲液PBS（pH 7.4）；IgG酶联免疫检测试剂盒、IgM酶联免疫检测试剂盒、IgA酶联免疫检测试剂盒（MABTECH生物公司）；脱脂牛奶（美国BD公司）；pNPP（Sigma公司产品）。

1.1.2仪器SHH·W21·Cr600三用恒温水浴箱（北京长源仪器设备厂）、RE300A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、SW-CJ-2FD双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）、GHP-9160隔水式恒温培养箱（上海-恒科学仪器有限公司）、LC-4012低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）、Synergy HT多功能酶标仪（美国BIC-TEK）、JA2103电子天平（上海民桥电子仪器厂）。

1.1.3实验动物SPF级昆明小鼠30只，雌雄各半，6～8周龄，体重（20±2）g，由昆明医科大学动物学部提供。

1.1.4艾叶购于大理中药材市场，由大理大学药学与化学学院杨永寿老师鉴定。

1.2方法

1.2.1艾叶多糖的提取浸提温度95℃，浸提时间2 h，超声波作用30 min，液料比为20：1。将提取液用旋转蒸发仪浓缩后，高速离心去沉淀，得到艾叶粗提液；saveg法除蛋白，重复4次；用95%乙醇沉淀多糖，收集沉淀，恒温干燥箱60℃干燥90 min，研磨后即得艾叶粗多糖粉末。

1.2.2实验动物分组共30只小鼠，随机分为3组，每组各10只，分别为艾叶多糖低剂量组（150 mg/kg）、艾叶多糖高剂量组（300 mg/kg）和正常对照组（生理盐水），连续灌胃10 d。

1.2.3艾叶多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响灌胃结束后次日，眼底静脉取血后将小鼠断颈处死，无菌操作取出腹腔液，台盼蓝染色计数，用Hank’s液调腹腔巨噬细胞数至1×106/mL，用8×106/mL的白假丝酵母菌悬液和调好的巨噬细胞悬液各20 μL涂片，湿盒内37℃孵育30 min，室温干燥后瑞氏染液染色。显微镜下观察吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。吞噬百分率=（吞噬白假丝酵母菌的巨噬细胞数/巨噬细胞总数）× 100%；吞噬指数=巨噬细胞吞噬白假丝酵母菌的总数/巨噬细胞总数。

1.2.4艾叶多糖对小鼠免疫器官重量的影响无菌操作取出小鼠的胸腺和脾脏，剪去脂肪和筋膜组织，置于无菌培养皿中用电子天平精确称取小鼠胸腺、脾脏质量，计算脾（胸腺）指数，脾（胸腺）指数=脾（胸腺）质量（mg）/体重（g）。

1.2.5艾叶多糖对小鼠脾T淋巴细胞增殖的影响采用MTT法测定。用Hank’s液冲洗出脾细胞并裂解红细胞，台盼蓝染色计数，调节脾细胞浓度为2×106/mL。将调好的脾细胞悬液和植物凝集素（PHA）（终浓度为50 μg/mL）各100 μL加至96孔细胞培养板，培养3 d，终止培养前4 h加入MTT（5 mg/mL）20 μL，37℃、5%CO2培养箱中继续培养4 h后，每孔加入三联液100 μL，过夜后用酶标仪测量OD570值。1.2.6艾叶多糖对小鼠抗体生成的影响采用ELISA双抗体夹心法测定血清IgG，IgM，IgA水平：使用瑞典MABTECH公司的ELISA for mouse IgG， IgM，IgA kit测定，按照说明书进行。并在酶标仪上于405 nm处测OD值。使用ELISACalc软件分别拟合出小鼠血清抗体IgA、IgG、IgM的标准曲线及拟合方程，OD值经拟合方程分别换算出小鼠血清抗体含量。

1.2.7统计学处理采用方差分析，数据处理采用SPSS17.0软件。

2　结果

2.1艾叶多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响见表1。

表1　艾叶多糖对小鼠吞噬指数、吞噬百分率的影响（±s，n=10）

表1　艾叶多糖对小鼠吞噬指数、吞噬百分率的影响（±s，n=10）

注：与对照组比较*P < 0.01；高剂量组与低剂量组比较**P<0.05。

组别对照组低剂量组高剂量组吞噬指数18.125±2.216 32.416±6.250*27.760±7.270**吞噬百分率15.156±2.099 24.946±4.193*21.719±2.246**

与对照组比较，艾叶多糖高、低剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率、吞噬指数均增大（P<0.01），差异有统计学意义，尤以低剂量组增加明显。

2.2艾叶多糖对小鼠免疫器官重量的影响见表2。

表2　艾叶多糖对小鼠免疫器官重量/体重比值的影响（±s，n=10）

表2　艾叶多糖对小鼠免疫器官重量/体重比值的影响（±s，n=10）

注：与对照组比较*P < 0.01，**P < 0.05；高剂量组与低剂量组比较***P>0.05。

组别对照组低剂量组高剂量组脾指数/(mg/g) 1.701±0.320 2.050±0.148**2.231±0.257***胸腺指数/(mg/g) 1.221±0.132 2.354±0.476*2.585±0.546***

艾叶多糖高、低剂量组与对照组比较，小鼠脾指数增大（P<0.05）、胸腺指数增大（P<0.01），差异有统计学意义，并随剂量增大作用增强。

2.3艾叶多糖对小鼠脾T淋巴细胞增殖的影响见表3。艾叶多糖高、低剂量组与对照组比较，小鼠脾细胞增殖试验OD值增大（P<0.01），差异有统计学意义。

表3　艾叶多糖对小鼠脾T淋巴细胞增殖的影响（±s，n=10）

表3　艾叶多糖对小鼠脾T淋巴细胞增殖的影响（±s，n=10）

注：与对照组相比*P<0.01；高剂量组与低剂量组比较**P>0.05。

组别对照组低剂量组高剂量组1 0.352 0.449 0.468 2 0.359 0.431 0.435 3 0.345 0.453 0.388 OD5704 0.396 0.451 0.446 5 0.376 0.404 0.402 6 0.369 0.425 0.403 7 0.365 0.391 0.405 8 0.345 0.449 0.435 9 0.376 0.431 0.402 10 0.361 0.428 0.442 xˉ±s 0.365±0.016 0.429±0.023 0.424±0.028

2.4艾叶多糖对小鼠抗体生成的影响见表4。

表4　艾叶多糖对小鼠血清IgA、IgG、IgM含量的影响（±s，n=10）

表4　艾叶多糖对小鼠血清IgA、IgG、IgM含量的影响（±s，n=10）

注：与对照组比较*P<0.01；高剂量组与低剂量组比较**P<0.01。

组别对照组低剂量组高剂量组IgA/( ng/mL) 134.596±0.953 137.734±0.862*140.344±0.828**IgG/( ng/mL) 107.280±0.994 119.584±0.876*130.483±0.777**IgM/( ng/mL) 277.450±0.835 280.818±0.921*287.649±0.829**

艾叶多糖高、低剂量组与对照组比较，小鼠血清IgA、IgG、IgM含量上升（P<0.01）；高剂量组与低剂量组比较变化相同（P<0.01），差异有统计学意义。

3　讨论

免疫包括特异性免疫和非特异性免疫，其中特异性免疫又包括细胞免疫和体液免疫。机体的免疫功能包括免疫防御：防止外界病原体的入侵及清除已入侵的病原体；免疫监视：发现和清楚体内的“非己”成分，主要是清除衰老、凋亡细胞和抗肿瘤作用；免疫自身稳定：通过自身免疫耐受和免疫调节两种主要的机制来达到免疫系统内环境的稳定。免疫系统与肿瘤的发生发展具有十分密切的关系，当宿主免疫功能低下或受抑制时，易发生肿瘤，而在肿瘤进行性生长时，肿瘤患者的免疫功能也会受到肿瘤的抑制，两者互为因果，双方因素的消长直接影响肿瘤的发生和发展。因此，增强机体免疫功能可提高免疫防御和免疫监视的能力，从而增强机体抗感染和抗肿瘤的能力。目前，大量的实验研究证明多糖对机体的非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫有广泛的影响〔5-10〕。多糖作为生物免疫调节剂，主要通过以下几个途径作用于人体的免疫系统：激活巨噬细胞，促进T细胞转化，活化Tc细胞，提高B淋巴细胞和NK细胞的数量与活性等〔11-12〕。

本研究在提取艾叶多糖基础上对其进行了小鼠体内的免疫活性研究。非特异性免疫是机体免疫系统的重要组成部分，单核巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一。当细菌、异物等抗原性物质进入机体后，可迅速被单核巨噬细胞系统吞噬和清除，因而巨噬细胞吞噬指数和吞噬百分比率的高低可以反映其吞噬功能的强弱。本实验结果表明，艾叶多糖能促进小鼠巨噬细胞的吞噬能力，尤以低剂量组增加明显，具有统计学意义，提示艾叶多糖能促进小鼠非特异性免疫功能。实验组胸腺、脾脏与对照组相比质量均增大，并随剂量增大作用增强，差异有统计学意义（P< 0.05～0.01），表明艾叶多糖能够促进小鼠脾脏细胞的增殖，增加小鼠抗体生成器官脾脏及胸腺的重量，提高小鼠的胸腺指数和脾指数。与文献报道艾叶多糖能增强巨噬细胞的非特异性吞噬功能结果一致〔13〕。脾淋巴细胞增殖试验结果表明，实验组OD570均较对照组增高，表明艾叶多糖能促进小鼠T淋巴细胞的增殖，提示艾叶多糖可作用于免疫细胞而增强细胞免疫功能，但高剂量组与低剂量组在实验所用浓度值时相比无统计学意义。通过对对照组和实验组小鼠血清抗体IgA、IgG、IgM含量的测定，结果显示艾叶多糖能增加小鼠抗体生成，表明艾叶多糖能促进小鼠的体液免疫功能。

研究结果提示，艾叶多糖对小鼠的非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫功能均有增强作用，为进一步开发利用艾叶资源提供了实验数据，但其具体作用机制尚需进一步研究。

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（责任编辑董杰）

Effect of Polysaccharide from Folium Artemisiae Argyi on Immune Function in Mice

Luo Xuan1, Hu Changmeng1, Shen Yuanjuan1, Zhang Shaofei1, Luo Qiulin1, Deng Duwei1, Bai Li1,2*
（1. Pre-clinical College, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China; 2. Key Laboratory of Insect Biological and Pharmaceutical Research of Yunnan Province, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China）

〔Abstract〕Objective：To research the effect and mechanism of polysaccharide from Folium Artemisiae Argyi Folium on immune function in mice. Methods: Mice were random divided into low dose, high dose and control group; 2 doses of polysaccharide of Folium Artemisiae Argyi and control medicine were administered orally to mice for 10 consecutive days. Then, the mice were executed, the weight of body, spleen and thymus, as well as the spleen and thymus index were measured. The phagocytosis of mice peritoneal macrophage was tested on Candida albicans. The change of cell- mediate immunity in the mice was determinated by splenic T lymphocyte proliferation assay. The serum level of immunoglobulin in the mice was detected by ELISA. Results: The polysaccharide from Folium Artemisiae Argyi increased the weight of immune organs, strengthened the phagocytosis of macrophage, the ability of B cell to produce antibodies and the proliferative ability of splenic T lymphocytes in mice. Conclusion: The polysaccharide from Folium Artemisiae Argyi could regulate mice immune function by increasing non-specific immune, cellular immunity and humoral immunity.

〔Key words〕polysaccharide from Folium Artemisiae Argyi; mouse; immune function

［中图分类号］R392

［文献标志码］A

［文章编号］1672-2345（2016）02-0015-04

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（81360319）；大理学院大学生科研基金资助项目（KYSX2014062）

［收稿日期］2015-06-17

［作者简介］罗旋，医学检验专业2011级本科生.

*通信作者：白丽，教授，博士．