乳腺癌17号染色体异倍体对HER-2表达的影响及临床病理学意义

张文进,刘月平,李云涛,吴雅轩,耿翠芝△



乳腺癌17号染色体异倍体对HER-2表达的影响及临床病理学意义

张文进1,刘月平2,李云涛1,吴雅轩1,耿翠芝1△

[摘要]目的探讨乳腺癌17染色体异倍体(多体、单体)对人表皮生长因子受体-2(HER-2)表达的影响及其临床病理学意义。方法收集2013年1～12月，同时采用免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)技术检测HER-2表达状态的乳腺浸润癌病例，共352例。根据17号染色体多体、单体及HER-2的表达情况分组，对各组患者的临床病理特征进行比较分析。结果17号染色体多体、单体与HER-2蛋白表达无相关性(P>0.05)；17号染色体多体与HER-2基因扩增呈负相关(r=-0.162，P=0.001);17号染色体单体与HER-2基因扩增呈正相关(r=0.282，P=0.000)。17号染色体多体组与HER-2阴性组比较，组织学分级，脉管瘤栓差异有统计学意义(P<0.05)。17号染色体多体组与HER-2阳性组比较，组织学分级，脉管瘤栓，Ki-67表达，ER、PR阳性表达差异有统计学意义(P<0.05)。17号染色体单体组与HER-2阴性组比较，PR阳性表达差异有统计学意义(P<0.05)。17号染色体单体组与HER-2阳性组比较，肿瘤大小差异有统计学意义(P<0.05)。17号染色体多体组与17号染色体单体组比较，脉管瘤栓，PR阳性表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论17号染色体多体、单体与HER-2的蛋白表达无相关性，而与HER-2基因扩增有相关性。17号染色体多体组具有独特的临床病理特点，可能提示乳腺癌的预后。

[关键词]乳腺肿瘤；人表皮生长因子受体-2；17号染色体多体；17号染色体单体

人表皮生长因子受体-2(HER-2)基因是与乳腺癌相关的重要癌基因。研究表明，30%的浸润性乳腺癌具有HER-2基因的扩增或过表达，HER-2的扩增或过表达与乳腺癌预后不良相关[1]。因此准确判断HER-2的状态对乳腺癌的治疗及判断预后有重要意义。异倍体的出现是否影响HER-2的状态及乳腺癌的临床病理特性，目前有截然不同的结论[2-3]。本研究应用免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)技术检测HER-2状态，结合其他临床病理参数，分析17号染色体异倍体(多体、单体)在乳腺癌中的临床病理学意义。

1材料与方法

1.1材料收集2013年1～12月本院乳腺中心就诊的352例原发性乳腺浸润癌患者的临床病理资料，所有乳腺癌组织标本均同时行IHC和FISH检测HER-2的表达。患者均为女性，年龄22～83岁，中位年龄51岁。均行手术治疗(改良根治术，保乳术，切除+前哨淋巴结活检术)，术前未行化疗、放疗及内分泌治疗，术后病理证实为乳腺浸润癌。其中浸润性导管癌289例，浸润性小叶癌14例，浸润性导管-小叶混合性癌19例，黏液腺癌3例，髓样癌2例，其他类型(乳头状癌、内分泌癌、筛状癌等)25例。

1.2主要试剂酸性亚硫酸钠为美国Simga产品，蛋白酶K为美国罗氏产品，GLP HER-2/CSP17探针购于北京金菩嘉公司。鼠抗人单克隆抗体、IHC试剂购于福州迈新生物公司。所有标记均设阳性对照并用PBS缓冲液代替一抗做阴性对照。

1.3方法

1.3.1组织标本处理手术切除后的组织标本立即用10%的中性缓冲甲醛液固定，根据组织大小固定时间为6～48 h。石蜡包埋后的标本制成厚度为4～5 μm的切片保存备用。

1.3.2IHC法检测HER-2蛋白表达4 μm厚的石蜡包埋组织切片经常规二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水，放入柠檬酸溶液缓冲液(10 mmol/L，pH6.1)置微波炉内(95 ℃，15 min)行抗原修复。采用SP染色法将切片孵育鼠抗人HER-2一抗置4 ℃冰箱过夜，生物素标记二抗室温孵育30 min，PBS缓冲液冲洗后滴加辣根酶标记的链酶卵白素孵育30 min，DAB-H2O2显色剂显色，苏木素复染并用中性树胶封片后观察结果。同时设立阴性对照、阳性对照保证质控。结果判读依据2013年美国临床肿瘤学会/美国病理医师学院(ASCO/CAP)联合发布的乳腺癌HER-2检测指南[4]所定的HER-2评分标准，HER-2阳性表达显示棕黄色均匀细颗粒位于细胞膜，根据阳性细胞比例和着色程度分为4级(只评价肿瘤浸润区，细胞质的染色被认为是非特异染色，原位癌区未被评价)。0：无染色或小于10%的肿瘤细胞有细胞膜染色；+：超过10%的肿瘤呈微弱或不完整的细胞膜着色；++：超过10%的肿瘤细胞呈现弱至中度的完整细胞膜着色或小于30%的肿瘤细胞呈现强的完整的胞膜着色；+++：超过30%的浸润性癌细胞胞膜成全周的强着色。

1.3.3FISH检测HER-2基因扩增将4 μm厚的甲醛固定石蜡包埋切片根据标准的预处理程序进行处理，切片经二甲苯脱蜡后依次浸入100%、80%、70%乙醇各脱水10 min，50 ℃下用30%[W/V]酸性亚硫酸钠处理组织切片20～30 min，2×SSC溶液中漂洗5 min。将组织切片浸泡在蛋白酶K工作液(200 μg/mL)中，37 ℃孵育20～30 min，将玻片置于73 ℃～78 ℃的变性液中浸泡5 min，依次置于70%、80%和100%乙醇中梯度脱水，置于45 ℃～50 ℃烤片机上预热3～5 min后与探针杂交，将10 μL探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片封片，置于湿盒中。运用GLPHER-2(17q11.2-q12)/CSP17探针(北京金菩嘉科技有限公司)标记HER-2和17号染色体中心粒。42 ℃保温箱杂交过夜后，滴加15 μL 4,6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)复染剂，暗处放置10～20 min后，荧光显微镜(BX51，日本Olympus公司，×1 000倍)下观察杂交区基因扩增情况。对照试验：已知HER-2基因表达为阳性的乳腺癌标本作为阳性对照；以同一切片中正常乳腺组织作自身对照。结果判读：试剂盒中有两种DNA探针，一种是标记为绿色荧光的17号染色体着丝粒(CSP17)；另一种是标记为红色荧光的HER-2基因(HER-2/neu)，而细胞核由DAPI染成蓝色。选择肿瘤细胞区随机统计30个细胞核的红色和绿色信号，每张切片选取不同的2个区域，每个区域随机选择3次并计算平均值，分别计算Ratio值(Ratio=30个细胞核中红色信号总数/30个细胞核中绿色信号总数)。依据2013年ASCO/CAP联合发布的乳腺癌HER-2检测指南[4],信号连接成簇视为基因扩增；信号呈点状Ratio≥2或HER-2基因拷贝数大于或等于6为阳性结果，提示样本中HER-2基因扩增；Ratio<2为阴性结果；Ratio<2且HER-2基因拷贝数大于或等于4和小于6可以选择增加计数细胞至100个，或重做FISH检测，并根据以上标准来判断最终结果。本研究将每个细胞CEP17的信号数大于或等于3视为多倍体(PS17)。每个细胞CEP≤1.25属于17号染色体单体。

1.4统计学处理采用SPSS19.0统计软件进行统计学处理，结果比较用χ2检验及Kappa一致性检验，参数间相关性采用Spearman相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.117号染色体多体、单体对HER-2状态的影响本组352例患者中，IHC+7例(2.0%)(图1A),IHC++305例(86.6%)(图1B、1C),IHC+++40例(11.4%)(图1D)。FISH阳性97例(27.6%)(图2A)，FISH阴性255例(72.4%)(图2B)。存在17号染色体多体者49例(13.9%)，其中单纯17号染色多体46例(图3A)，伴HER-2基因扩增者3例。17号染色体单体12例(3.4%)为单体(图3B)，均伴HER-2基因扩增。17号染色体多体、单体都分布在IHC++、IHC+++组。17号染色体多体与HER-2蛋白表达无相关性(r=-0.074，P=0.137)。17号染色体单体与HER-2蛋白表达无相关性(r=0.078，P=0.136)。17号染色体多体在FISH阴性组比例为18%，明显高于FISH阳性组的3.1%，17号染色多体与HER-2基因扩增呈负相关(r=-0.162，P=0.001)。17号染色体单体在FISH阳性组比例为12.4%，明显高于FISH阴性组(0%)，17号染色单体与HER-2基因扩增呈正相关(r=0.282，P=0.000)，见表1。

表1　17号染色体多体、单体、二倍体患者的HER-2状态分布情况[n(%)]

*：不存在异倍体情况的患者。

2.217号染色体多体组与HER-2阴性及HER-2阳性组临床病理特征关系本研究中17号染色体多体患者46例(排除伴HER-2扩增的3例)，不存在异倍体的患者291例，其中HER-2阴性209例，HER-2阳性82例。17号染色体多体组组织学分级Ⅲ级者占39.1%，明显高于HER-2阴性组的21.1%，差异有统计学意义(χ2=5.279，P=0.022)；17号染色体多体组有脉管瘤栓者为69.6%，明显高于明显高于HER-2阴性组的34.9%，差异有统计学意义(χ2=18.674，P=0.000)。17号染色体多体组组织学分级Ⅲ级者占39.1%，明显低于HER-2阳性组的52.5%，差异有统计学意义(χ2=5.845，P=0.016)；17号染色体多体组Ki-67>40%者占13.1%,明显低于HER-2阳性组的34.2%，差异有统计学意义(χ2=9.797，P=0.007)；17号染色体多体组ER、PR阳性率为91.3%、82.6%，明显高于HER-2阳性组的72.0%和57.3%，差异有统计学意义(χ2=6.631，P=0.010；χ2=8.450，P=0.004)；但是17号染色体多体组有脉管瘤栓者为69.6%,明显高于HER-2阳性组的45.1%，差异有统计学意义(χ2=7.086，P=0.008)，见表2。

A:IHC+;B:IHC++/FISH-;C:IHC++/FISH +;D:IHC+++。

图1病理切片

A：FISH阳性；B：FISH阴性。

图2HER-2荧光原位杂交图像

A：多体；B：单体。

图317号染色体图像

表2　17号染色体多体、HER-2阴性和HER-2阳性各组相关临床病理参数的比较[n(%)]

续表2　17号染色体多体、HER-2阴性和HER-2阳性各组相关临床病理参数的比较[n(%)]

a：17号染色体多体组与HER-2阴性组比较；b：17号染色体多体组与HER-2阳性组比较；*：仅导管癌有组织学分级。

2.317号染色体单体组和HER-2阴性及HER-2阳性组临床病理特征的关系本研究中存在17号染色体单体患者12例，均伴HER-2基因扩增。17号染色体单体组的PR阳性率为50.0%，明显低于HER-2阴性组的81.3%，差异有统计学意义(χ2=6.874，P=0.009)。17号染色体单体组肿瘤直径大于2 cm的占16.7%，明显小于HER-2阳性组的56.1%，差异有统计学意义(χ2=6.513，P=0.011)，见表3。

2.417号染色体多体组与单体组临床病理参数比较17号染色体多体组有脉管瘤栓的占69.6%，明显高于17号染色体单体组的25.0%，差异有统计学意义(χ2=7.899，P=0.005)。17号染色体多体组的PR阳性率为82.6%，明显高于17号染色体单体组的50.0%，差异有统计学意义(χ2=5.527，P=0.019)，见表4。

表3　17号染色体单体、HER-2阴性和HER-2阳性各组相关临床病理参数的比较[n(%)]

a：17号染色体单体组与HER-2阴性组比较；b：17号染色体单体组与HER-2阳性组比较；*：仅导管癌有组织学分级。

表4　17号染色体多体与单体相关临床病理参数的比较

续表4　17号染色体多体与单体相关临床病理参数的比较

*：仅导管癌有组织学分级。

3讨论

乳腺癌HER-2基因的状态，不仅是靶向治疗的指征，还有助于判断乳腺癌患者的预后，指导化疗和内分泌治疗方案的选择。HER-2基因检测时常出现17号染色体异倍体现象，这种遗传学改变是否与HER-2的表达及乳腺癌的不良预后有关，尚没有一致意见。研究显示，13%～46%的浸润性乳腺癌患者癌细胞的17号染色体为非整倍体[5-6]。本研究中17号染色体异倍体的比例为17.3%，其中17号染色体多体49例，占13.9%，17号染色体单体为12例，占3.4%。Varshney等[7]发现17号染色体多体的比例随HER-2蛋白表达水平的增加而增加。而Wang等[8]认为这种遗传学改变可能与蛋白表达无关。本研究发现17号染色体多体、单体都分布在IHC++、IHC+++组，17号染色体多体、单体与HER-2蛋白表达无相关性。本研究还发现17号染色体多体在FISH阴性组比例明显高于FISH阳性组，17号染色多体与基因扩增呈负相关。17号染色体单体主要分布在FISH阳性组，17号染色单体与基因扩增呈正相关。进一步证明17号染色体多体可能是IHC++或IHC+++，但是FISH无扩增或低扩增的原因,17号染色体单体是IHC++,但是FISH存在扩增的原因[9-10]。

Vanden等[2]发现单纯17号染色体多体组和HER-2阳性组相比，具有更低的肿瘤分级，更高的ER、PR阳性率，其临床病理特征和HER-2阴性患者相似。李坚等[11]认为单纯17号染色体多体患者的临床病理特征和HER-2阴性患者基本相似，和HER-2阳性患者相比具有更低的激素受体阴性率及低Ki-67表达。本研究中17号染色体多体组与HER-2阳性组相比具有更低的肿瘤分级、更低的Ki-67表达，更高的ER、PR阳性率和高脉管瘤栓率。17号染色体多体组与HER-2阴性组相比有更高的脉管瘤栓率和组织学分级。17号染色体多体组与17号染色体单体组比较，具有更高的脉管瘤栓率及高PR阳性率。说明17号染色体多体组的临床病理特征既不同于HER-2阳性组，又与HER-2阴性组有差别，具有独特的生物学行为。较多脉管瘤栓的出现，意味着17号染色体多体组患者肿瘤细胞对血管、淋巴管的侵袭能力增强，早期发生全身的微转移可能性大，更容易出现内脏转移和脑转移[12]。

17号染色单体在乳腺癌中出现的较少，本研究中17号染色体单体占3.4%，且HER-2基因的FISH检测均为阳性，与蒋会勇等[13]的报道一致。Risio等[14]认为17号染色单体的患者与整倍体FISH阳性患者的预后明显不同且对靶向治疗不敏感。本研究中17号染色体单体患者肿瘤直径较HER-2阳性患者小；17号染色体单体患者比HER-2阴性患者PR阳性率低。但由于样本量偏小，以上数据尚不能确切说明17号染色体单体患者与其他类型乳腺癌在临床病理特征上存在明显差异，但是否影响肿瘤发展还需要进一步的研究。

综上所述，笔者认为17号染色体多体、单体是影响HER-2基因FISH检测结果的重要因素。17号染色体异倍体导致乳腺癌临床病理特征出现一些差异，尤其是17号染色体多体组与其他组乳腺癌差异更明显，可能与乳腺癌治疗和预后有重要关系。

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(河北医科大学第四医院：1.外一科；2.病理科，石家庄 050035)

Impact of chromosome 17 heteroploid of breast cancer on HER-2 expression and its clinicopathologic significance

Zhang Wenjin1,Liu Yueping2,Li Yuntao1,Wu Yaxuan1,Geng Cuizhi1△

(1.First Department of Surgery;2.Department of Pathology,Fourth Hospital,Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei 050035,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the impact of chromosome 17 heteroploid (polysomy,haploid) of breast cancer on the expression of human epidermal growth factor receptor 2(HER-2) and its clinicopathologic significance.MethodsA total of 352 cases of invasive breast cancer were collected from January to December 2013.The expression of HER-2 was detected by simultaneously using the fluorescent insituhybridization(FISH) and mimunohistochemistry.The cases were divided into the groups according to the chromosome 17 polysomy,haploid and the expression of HER-2.The clinicopathological features were analyzed and compared among groups.ResultsThe chromosome 17 polysomy and haploid had no correlation with HER-2 protein expression(P>0.05);chromosome 17 polysomy was negatively correlated with HER-2 gene amplification(r=-0.162，P=0.001);chromosome 17 haploid was positively correlated with HER-2 gene amplification(r=0.282，P=0.000).Compared with the HER-2- negative group，the chromosome 17 polysomy group had a statistically significant difference in histological grade and vascular tumor thrombus (P<0.05).Compared with the HER-2-positive group,the chromosome 17 polysomy group had a statistically significant difference in histological grade,vascular tumor thrombus,Ki-67 expression,ER positive expression and PR positive expression (P<0.05).Compared with the HER-2- negative group,the chromosome 17 haploid group had a statistically significant difference in PR positive expression (P<0.05).The tumor diameter in the chromosome 17 haploid group had a statistically significant difference compared with the HER-2-positive group(P<0.05).Compared with the chromosome 17 haploid group,the chromosome 17 polysomy group had a statistically significant difference in vascular tumor thrombus and PR positive expression(P<0.05).ConclusionThe chromosome 17 polysomy and haploid have no correlation with the HER-2 protein expression,but associated with HER-2 gene amplification.The chromosome 17 polysomy group has unique clinicopathological features,which may indicate the prognosis in the patients with breast cancer.

[Key words]breast neoplasms;HER-2;chromosome 17 polysomy;chromosome 17 haploid

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.023

作者简介：张文进(1971-),硕士，主治医师,主要从事乳腺肿瘤方向研究。△通讯作者，E-mail:gengcuizhi@hotmail.com。

[中图分类号]R737.9

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)09-1228-05

(收稿日期：2015-09-22修回日期：2015-12-14)