都柳江粗唇种群线粒体DNA Cyt b基因和D-loop序列组成及遗传多样性

刘　伟，代应贵，袁振兴，孙际佳，刘　丽

(1.贵州大学动物科学学院/贵州大学特种水产研究所，贵阳　550025；2.华南农业大学动物科学学院，广州　510642)



刘伟1，代应贵1，袁振兴1，孙际佳2，刘丽2

(1.贵州大学动物科学学院/贵州大学特种水产研究所，贵阳550025；2.华南农业大学动物科学学院，广州510642)

摘要：以采自都柳江40尾粗唇(Leiocassis crassilabris)个体为样品，采用PCR和DNA测序技术对粗唇都柳江种群Cyt b基因和D-loop序列进行了分析。获得了长度分别为1 118 bp、776～778 bp的粗唇Cyt b基因、D-loop序列。2段序列的碱基组成均为A+T的含量高于G+C的含量，但Cyt b基因碱基变异率(0.27%)显著低于D-loop的碱基变异率(3.34%～3.35%)。对粗唇D-loop序列结构进行了分析，识别了其终止序列区、中央保守区和保守序列区等的特征序列。都柳江粗唇40个个体Cyt b基因、D-loop序列中分别有3、20个多态位点，分别定义了4、10种单倍型。都柳江粗唇种群Cyt b基因和D-loop序列的单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数和平均核苷酸差异数分别为 0.146、0.000 13、0.150和0.404、0.003 17、2.444。都柳江粗唇种群遗传多样性较低，开展该种鱼类种群遗传多样性的研究和保护十分必要。

关键词：都柳江；粗唇(Leiocassis crassilabris)；线粒体DNA；Cyt b 基因；D-loop；遗传多样性

线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)具有结构简单、进化速率快、母系遗传等特点，其中一些基因已被广泛用于鱼类遗传多样性和保护生物学研究的重要标记。Cyt b基因进化速率较慢，但易于用通用引物进行扩增，为mtDNA中结构和功能被了解得最清楚的蛋白质编码基因之一，已被用于鱼类种内遗传变异的研究[2-3]。线粒体DNA D-loop，又称线粒体DNA控制区，为非编码基因，受自然选择压力较小，发生突变并被保留下来的可能性大，因此比线粒体其它基因进化快，可被用于种内遗传变异的分子标记[4]。结合线粒体DNA Cyt b基因和D-loop 2种分子标记方法，可以从不同角度揭示鱼类种群遗传变异及多样性的特点。

1材料与方法

1.1实验材料

1.2总DNA提取、扩增及测序

采用北京天根生化科技有限公司提供的DNA提取试剂盒，并按照试剂盒提示的操作步骤进行总 DNA 的提取。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的质量和纯度，并于-20 ℃保存、备用。

用于扩增Cyt b基因、D-loop的引物由上海生物工程有限公司提供并合成，Cyt b基因引物序列分别为L14724:5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′和H15915:5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′；D-loop引物序列分别为D-loop-F:5′-ACCCCTGGCTCCCAAAGC-3′和D-loop-R:5′-ATCTTAGCA TCTTCAGTG-3′。PCR反应体系为25 μL，其中包括2×ExTaqBufffer 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL用灭菌双蒸水补至25 μL。PCR反应的条件参照文献[9-10]所用条件。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送往上海生物工程有限公司纯化及测序，测序引物为PCR扩增引物。

1.3数据处理

2结果与分析

表1　都柳江粗唇　种群Cyt b基因的变异位点及单倍型

注:圆点(·)表示与 Hap_1 相同的碱基。表3同。

Cyt b基因中，T、C、A和G 4种碱基的平均含量为29.1%、28.0%、29.7%和13.2%，A+T的含量(58.8%)高于G+C(41.2%)的含量，以G的含量最低(表2)。Cyt b基因密码子第1位上4种核苷酸使用频率相差不大；密码子第2位上T的使用频率最高(42.6%)，分别为A、G的2倍、3.46倍；密码子第3位上A的使用频率最高，以G的最低。

2.2.1D-loop序列的组成

2.2.2D-loop序列的结构

表2　都柳江粗唇　种群线粒体DNA Cyt b基因和D-loop序列碱基组成及变异率

注：ETAS，终止序列区；CD，中央保守区。

表3　都柳江粗唇　种群线粒体DNA D-loop的变异位点及单倍型

图1　都柳江粗唇　种群线粒体DNA D-loop部分序列

表4　都柳江粗唇　种群线粒体DNA Cyt b基因

3讨论

致谢：感谢贵州大学动物科学学院动物分子生物学实验室曾智勇教授对本研究中分子生物学实验的指导和帮助。

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(责任编辑：张潇峮)

Composition and genetic diversity of mitochondrial DNA Cyt b gene and D-loop sequences in the population of Leiocassis crassilabris from the Duliu River

LIU Wei1,DAI Ying-gui1,YUAN Zhen-xing1,SUN Ji-jia2,LIU Li2

(1.CollegeofAnimalSciences,GuizhouUniversity/SpecialFisheriesResearchInstitute,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China;2.CollegeofAnimalSciences,AgriculturalUniversityofSouthChina,Guangzhou510642,China)

Abstract：The sequences of Cyt b gene and D-loop in the species were analyzed using the methods of PCR and DNA sequencing according to the 40 individuals of L.crassilabris respectively from Dushan,Sandu,Rongjiang and Congjiang along the Duliu River.The sequences of 1 118 bp of the Cyt b gene and 776～778 bp of the D-loop were obtained respectively,and the quantity proportion of bases A+T in total bases was higher than that of bases G+C in both of the two sequences but the substitution rate of bases in the sequence of Cyt b gene (0.27%) was obviously less than that of D-loop (3.34%～3.35%) in the population.The characteristic sequences in the extended termination associated sequence,the central conserved domain and the conserved sequence block of D-loop were identified in L.crassilabris.3 and 20 variable loci were detected as well as 4 and 10 haplotypes were defined respectively for the sequences of Cyt b gene and D-loop in the 40 individuals of L.crassilabris from the Duliu River.The haploidtype diversity,nucleotide diversity and average number of nucleotide differences were 0.146,0.000 13,0.150 and 0.404,0.003 17,2.444 respectively on the basis of the sequences of Cyt b gene and D-loop in the population.The population of L.crassilabris had low genetic diversity in the Duliu River now.Therefore,it′s necessary to study and protect the genetic diversity of population of L.crassilabris from the Duliu River.

Key words：Duliu River;Leiocassis crassilabris;mtDNA;Cyt b gene;D-loop;genetic diversity

收稿日期：2015-08-23；

修订日期：2016-02-19

第一作者简介：刘伟(1992-)，男，硕士研究生，专业方向为水产动物遗传育种与种质资源学。E-mail:892913900@qq.com通讯作者：代应贵。E-mail:daiygui@163.com

中图分类号：S917.4

文献标识码：A

文章编号：1000-6907-(2016)03-0010-06

资助项目：贵州省留学人员科技活动项目[黔人项目资助合同(2013)10];国家公益性行业(农业)科技专项(201303048)