青香蕉苹果α—法尼烯合酶基因启动子的克隆及序列分析

王亚男　刘晓楠　戚伟　宋媛媛　张渝洁　成妮妮

【摘 要】α-法尼烯的合成及α-法尼烯合酶基因的表达调控机制的研究在苹果等虎皮病的防治中具有重要作用。本实验利用Tail-PCR技术克隆了青香蕉苹果中α-法尼烯合酶基因的启动子序列，长度为1235bp。序列分析结果发现，该启动子序列含有明显的启动子特征序列TATA-box和CAAT-box，还有含有GARE-motif，TATC-box，TGA element等赤霉素和生长素等激素响应元件，HSE，ARE等热胁迫响应元件，大量的光反应元件G-box，GA-motif，GAG-motif，以及MYB结合位点MBS。序列分析表明该启动子可能受到激素、温度和光的调节。

【关键词】α-法尼烯合酶；启动子；虎皮病

α-法尼烯是一种普遍存在于植物体内的倍半萜类次生代谢物质，研究发现果皮中α-法尼烯的生物合成是通过类异戊二烯途径中的甲羟戊酸途径[1-2]。多年来的研究普遍认为，在储存过程中倍半萜α-法尼烯在果皮尤其是果皮蜡质中的积累是引起苹果和梨果实中的重大生理病害—虎皮病的主要原因[3-6]。Busatto等（2014）研究发现，α-法尼烯及其氧化产物共轭三烯（CTols）一个新的作用即作为苹果果实褐变的信号开关。研究表明苹果虎皮病发生过程中多酚提取液的变化也与乙烯合成抑制剂1-MCP有关。这些代谢物积累的变化与参与这个途径的基因以及两种特异的挥发物α-法尼烯和共轭三烯（Ctols）的最终氧化形式6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO）关系密切[7]，这与Whitaker等（2000）报道的MHO 与苹果虎皮病发病率之间存在正相关关系，且只有在发病的果实上才能检测到MHO一致[6]。候真等（2013）在研究MHO对苹果虎皮病发生和果皮活性氧代谢的影响时发现，外源MHO可能通过降低抗氧化酶活性，进而参与苹果虎皮病的发病过程[8]。而Xie等（2014）研究还发现，梨（‘dAnjou，Pyrus communis L.）果实储存过程中，在乙烯产生和成熟度与虎皮病发生方面对1-MCP非常敏感[9]。

通过以上研究发现，α-法尼烯及其氧化产物与虎皮病发生关系密切，而α-法尼烯含量及α-法尼烯合酶表达模式可能受到1-MCP影响或乙烯的调节。因此，仅通过研究α-法尼烯合酶基因本身很难真正阐明虎皮病发生的分子机制，尤其是研究外界环境对虎皮病发生率的影响时，此时α-法尼烯的产生与其代谢途径中的关键酶的表达量有重要关系。

本文拟通过分离α-法尼烯合成途径的最后一个关键酶α-法尼烯合成酶基因的启动子序列，对其结构进行分析，研究其所含有的顺式作用元件，为下一步植物表达载体的构建，以及光、激素、温度、氧气等因素对启动子调控的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

青香蕉苹果幼苗；大肠杆菌DH5α，本实验室保存；Ex Taq DNA聚合酶，dNTP Mix，pMD18-T载体克隆试剂盒，Genome Walking Kit，购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。测序由上海生物工程有限完成。

1.2 方法

1.2.1 苹果幼叶基因组DNA的提取

采用新型植物基因组提取试剂盒（DP320）（天根生化科技（北京）有限公司），具体步骤参照说明书。

1.2.2 引物设计

利用热不对称交织 PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，Tail-PCR）技术扩增α-法尼烯合成酶基因的启动子序列。根据GenBank中注册的青香蕉苹果α-法尼烯合成酶基因（AFS）cDNA序列（张元湖，李萌等，2004，登录号AY563622），在起始密码子下游约400bp的长度内设计3条退火温度较高（60℃以上）的特异引物SP1，SP2，SP3，引物方向为需要扩增的未知区域方向。同时设计了5条退火温度较低（44℃）的简并引物。

特异引物：SP1： 5- GCCTAGTTTTCGGACGCTGTCAATG-3；SP2： 5-TTCCGATACTCATCTCCCTGC ACTCAGTT-3；SP3： 5- AGTAAG AGGCTTCAGGTTCGGGTTTCAT-3。

简并引物：Genome Walking Kit 自带引物AP1-AP4。

1.2.3 Tail-PCR过程

PCR扩增程序参照Genome Walking Kit说明书

第1次PCR：以获得的青香蕉苹果幼叶的基因组DNA为模板，以SP1分别与简并引物AP1-AP4配对，进行目的片段的PCR扩增。第2次PCR：将第1次PCR产物稀释1000倍为模板，以SP2分别与AP1-AP4配对，进行目的片段的扩增。第3次PCR：将第2次PCR产物稀释500倍为模板，以SP3分别与AP1-AP4配对，进行目的片段的扩增。每次反应完成后，取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 产物回收及测序

用天根生化科技（北京）有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒切胶回收第 3次 PCR产物较长较亮片段，回收片段克隆进pMD 18- T载体中并进行测序。

1.2.5 α-AFS启动子顺式作用元件分析

利用plantCARE结合PLACE在线预测软件对青香蕉苹果的启动子序列进行顺式作用元件预测和比较分析。

2 结果与分析

2.1 3次Tail-PCR产物的电泳结果

图1 三次TAIL-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

（A，B，C）分别代表1，2，3次TAIL-PCR产物的电泳结果。M：DNA Marker DL 2 000；泳道1，2，3，4分别代表特异引物与简并引物AP1-AP4分别配对的PCR产物。

由图1A看出，各引物对扩增的产物都以弥散带为主，从图1B看出，第2次PCR中SP2与AP1组成的引物对扩增产物中出现两条比较亮的条带（泳道1），一条约750bp，一条约1400bp，其它3对引物出现2条200-300bp的条带，其它带较为弥散。图1C看出，各引物对都出现750bp以上的较亮条带，且每对引物的最大条带丰度都较高。

2.2 目的片段回收及测序

分别切胶回收图 1 C泳道1和泳道4中较大的条带（约1400bp），泳道2和泳道3中最亮的条带（约1800bp）的PCR产物，克隆进pMD 18-T 载体中测序。测序结果显示泳道1和泳道4的产物长度为1320bp，与GenBank中注册的青香蕉α-法尼烯合成酶基因cDNA序列（登录号AY563622，张元湖，李萌等，2004）的重叠区域比较后，初步确定该序列为青香蕉苹果中α-法尼烯合成酶基因的上游序列，命名为pAFS。而泳道2，3的产物长度为1771，1863，但是在与青香蕉α-法尼烯合成酶基因cDNA重叠区比对时未发现重叠区序列，说明泳道2，3的产物为非目的带。

2.3 pAFS启动子结构分析和顺式作用元件预测

利用PLACE和PlantCARE 网站对pAFS片段进行启动子元件的在线分析预测表明，该序列具有许多明显的TATA框和CAAT框，同时还具有与激素相关的元件（图2），如位于ATG上游-41和-65处以TATC-box为核心的赤霉素响应元件TATCCCA，分别位于该片段负连-727和-904处的两个GARE-motif序列AAACAGA是赤霉素反应元件，位于ATG

上游负连上-192处的AACGAC是生长素反应元件。该序列负连的-1196还具有MYB结合位点MBS，其核心序列为 TAACTG。以上各种元件的存在说明该序列的功能可能跟激素相关。同时，在ATG下游+34和负连的+48处分别有一个HSE元件AGAAAATTCT和ARE元件TGGTTT，前者参与热胁迫反应，后者是厌氧诱导所必须的，说明该启动子可能还受温度和氧气的调节。另外，该启动子还具有大量的与光反应有关的元件如G-box，GA-motif，GAG-motif等。而且在ATG上下游附件各种调控元件相对集中。

3 讨论

近年来，诸多研究表明苹果虎皮病发生过程中，内源乙烯的含量与α-法尼烯合酶基因的表达和α-法尼烯的含量具有一定的相关性，Pechous等（2005）等对AFS1基因的转录产物mRNA进行Northern杂交的分析表明乙烯合成抑制剂-甲基环丙烯（1-MCP）处理后，AFS1的mRNA在冷藏4周后则快速下降，到第8周则已经几乎检测不到[10]。另有研究表明，在整体上，1-MCP处理的果实中α-法尼烯合酶基因的转录水平比未处理的要低[11]。这些实验都说明了乙烯诱导AFS1基因的转录。由α-法尼烯合酶表达模式受乙烯调节表明，该酶基因启动子可能有响应乙烯调节的顺式作用元件。这些实验结果都为研究与乙烯诱导表达量增加有关的AFS基因启动子区域乙烯响应元件提供了有价值的信息，很多实验室已开始着手对包含乙烯响应元件的AFS基因启动子进行克隆研究。

本实验利用热不对称交织PCR（Tail-PCR）技术，克隆了青香蕉苹果中α-法尼烯合成酶基因起始密码子ATG上游约1235bp及下游83bp序列，经PLACE软件分析后发现其具有多个启动子特征序列TATA-box和增强子特征序列CAAT-box，同时具有G-box等多个光反应元件和多种激素反应相关元件。在ATG下游还具有一个高温反应元件HSE，由此推测该序列具有启动子功能，且可能与激素、高温、光等因素的调控相关。为了研究该启动子的核心区域及各调控元件的调控作用，我们目前正在利用启动子删除技术和定点突变技术构建一系列与GUS报告基因相连的表达载体，通过GUS活性检测，对启动子个序列的功能进行更细致的研究。

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[责任编辑：杨玉洁]