紫外可见分光光度计检定过程中的注意事项

张宏磊

紫外可见分光光度计是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对物质进行定性和定量分析的仪器。在生物制药、精细化工、环境监测等领域有着广泛应用，并被纳入《中华人民共和国强制检定的工作计量器具明细目录》，需要根据检定规程定期检定。虽然目前检定机构在检定紫外可见分光光度计时均严格执行JJG178-2007《紫外，可见，近红外分光光度计检定规程》，但实际检定过程中还是经常会出现对同一台仪器在不同的检定机构给出的检定结果并不完全相同，也会有经判定不合格的仪器返厂修理时并未发现问题的情况。实际上很多时候并不是仪器发生了问题，只要我们的检定人员在检定过程中注意一些细节的问题，就可以避免误判情况的发生。

1 波长示值误差项目检定中需注意的问题

波长示值误差是一项重要指标，规程中对该项指标的检测，给出了多种标准物质进行选择。选择哪一种标准物质，要根据仪器的情况。一般最常用的波长标准物质是氧化钬玻璃滤光片、镨钕玻璃滤光片。因其使用最方便（不用打开仪器光源部分），汞灯等波长标准需放到光源部分，操作起来相对麻烦。但由于氧化钬玻璃等滤光片需要通过高等级紫外可见分光光度计对参考波长定值后才可用于对相对等级较低的仪器进行检测，所以使用时需充分考虑定值时使用的紫外可见分光光度计的性能，尤其需要考虑到仪器的光谱带宽，定值用仪器的光谱带宽多设定为2nm。但大多数仪器的光谱带宽是固定的，而且较大，尤其是低档仪器，如752型紫外可见分光光度计光谱带宽为4nm。表1、表2分别为同一台紫外可见分光光度计在其他条件不变下，光谱带宽分别设定为0.5nm、2.0nm、5.0nm时使用氧化钬玻璃和镨钕滤光片扫描得到的峰值数据，可见当仪器的光谱带宽发生变化时，使用氧化钬玻璃或镨钕玻璃滤光片检测得到的波长误差存在着较大的差异，对于光谱带宽较大的仪器甚至部分波峰检测不到。而且对于具备自动扫描功能的仪器，扫描速度同样对检测结果有着不可忽视的影响。如表3所示。

表1

表2

所以如果我们的定值机构能够分别给出滤光片在不同光谱带宽下所对应的峰值，详细描述定值所用仪器的各项参数。我们的检定员在检定过程中根据被检仪器的实际光谱带宽选择合理的参考值，并尽量将仪器扫描速度等参数设定为滤光片定值时所使用的紫外可见分光光度计的参数，将有效避免因定值仪器与被检仪器因参数设定的差异引入的测量误差。而且虽然镨钕玻璃滤光片的波长范围可以达到（500～900）nm，但并不适合将镨钕玻璃滤光片作波长示值误差判定的唯一标准，原因是镨钕玻璃滤光片的峰值并不尖锐，比较圆滑。仅可作为对某一空白波段的补偿。例如使用氧化钬玻璃滤光片作为主标准器检测（200～700）nm范围的波长值，再用镨钕玻璃滤光片补充（700～900）nm波段的波长值。对于光谱带宽不可调且较大的仪器如果使用滤光片检定不合格时切不可急于判定，而应该改用汞灯等自然标准重新对仪器波长误差进行检定，以此为依据做出判断。

表3

2 透射比示值误差检定中需注意的问题

透射比的误差反映了仪器测光的准确度，使用的标准器通常为：标准溶液、金属镀膜滤光片和中性滤光片。实际检定中多使用金属镀膜滤光片和中性滤光片，其中金属镀膜滤光片可以满足紫外光段和可见光段的检定，中性滤光片仅可满足可见光段的检定。检定中经常会发现部分单光束低端仪器（如721型分光光度计）透射比示值误差超差的现象，实际上造成这种结果可能是由下列原因造成的：

2.1 分光光度计入射光的光斑较大

大部分单光束紫外可见分光光度计入射光的光斑较大，用滤光片检定时，滤光片的支架的边缘遮挡了部分光，造成检定结果超差。解决方法：以空气为参比，对分光光度计透射比调节100%时，在比色皿中插入未安装滤光片的空白支架。

2.2 检定用滤光片对光的反射引起的误差

这种现象主要发生在使用金属镀膜滤光片检定仪器透射比误差时。用于检定仪器透射比误差的理想滤光片应能够均匀的降低入射光的强度，不存在对入射光的反射。但目前所使用的金属镀膜滤光片的表面均会对入射光产生一定的反射，造成测量误差，这个现象在对使用透镜式光路的低端紫外可见分光光度计检定中尤其明显。而且金属镀膜滤光片存在计量性能不稳定的问题，由于该滤光片表面是一层镀膜，如果镀膜表面受到污染，在进行清理时是很容易对镀膜造成破坏，改变滤光片原有数值的。解决方法：使用金属镀膜滤光片对紫外光段的透射比误差进行检定，使用中性滤光片对可见光段的透射比误差进行检定，当发现仅紫外光段透射比误差不合格时，使用标准溶液进行复测，以标准溶液的检定结果作为紫外光段透射比误差的最终检定结果。

2.3 检定用滤光片入射面选择所造成的误差

由于滤光片制作工艺水平的限制，滤光片的厚度不可能是完全均匀的，更不能保证滤光片放入比色皿架后，入射光能够完全垂直照射在滤光片上，这就造成同一个滤光片，选择的入射面不同时，测得的透射比示值也是不同的，造成测量误差，甚至误判。解决方法：对滤光片定值时，如果定值机构在定值时能够考虑到这个问题，根据定值时的实际情况在滤光片上标明入射光的方向或入射面，检定仪器时根据定值机构的标注选择滤光片入射面，放置滤光片，就可以有效减小因滤光片入射面选择不同造成的测量误差。

3 杂散光检定中需要注意的项目

杂散光是紫外可见分光光度计非常重要的关键技术指标。它是紫外可见分光光度计分析误差的主要来源，它直接限制被分析测试样品浓度的上限。当一台紫外可见分光光度计杂散光一定时，被分析的试样浓度越大，其误差分析就越大。杂散光的检测可以使用10g/L的NaI碘化钠溶液和50g/L的NaNO2亚硝酸钠溶液，也可以使用截止滤光片，只要该片在某区域的透射比（或吸光度）值与检定规程中的指标符合误差理论（标准器与被检器的关系）即可。

杂散光的来源有很多，主要有一下几个方面1灰尘污染光学元件，2光学元件被损伤或有其他缺陷，3光学系统屏蔽不好，4狭缝的缺陷等，其中光栅是杂散光的主要来源，它产生的杂散光占总杂散光的80%以上。杂散光一般有两种出现形式：一是，被测量波长和杂散光波长相同，会直接射到检测器上，而没有经过样品。造成这种情况的主要原因是样品与其他光学接线零件的散射即反射。二是，杂散光是测定波长之外的偏离正常光路到达检测器的光线，这是因光学系统本身缺陷导致，比如灰尘散射、光学系统像差、多余反射面等。在检定杂散光时，标准滤光片法在实际检定中运用比较多，在光谱透光率的检测器灵敏度较低、光强强度较弱时，会加大杂散光比例，因此，首先应该对紫外分光光度计中（200～220）nm区域内的杂散光进行检定。

4 小结

总之，在紫外分光光度计检定过程中需要注意的事项很多，上文主要是介绍了紫外可见分光光度计的波长示值误差、透射比示值误差差是检定过程中最重要的三个检定中注意的事项和杂散光的问题，而且这三个检定项目在检定过程中很容易因一些检定中的细节问题注意不够造成误判，以上主要介绍了在检定过程中对以上三个项目在检定过程中的一些体会和经验，希望能够对我们的检定员在日常检定中有所帮助。另外，也要重视电源电压适应性与吸收池配套性的影响，分析造成误差的原因，找到解决措施。同时在使用紫外分光光度计的过程中，也要做好仪器的日常维护工作，只有做好方方面面的工作，才能确保紫外分光光度计保持最佳的工作状态。

[责任编辑：汤静]