PCR仪温度校准的研究

曾颖

【摘 要】本文针对用于DNA扩增的PCR仪其试样环境温度的测量装置及测温位置进行研究，提出使用薄膜铂电阻对PCR仪进行快速准确测温，并在实验数据的对比分析后证明将测温敏感点放置在试管的液体中的位置最满足DNA实验需要。

【关键词】PCR仪；温度；测温位置；薄膜铂电阻

0 引言

PCR技术是一项在短时间内体外大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术[1]，PCR仪的工作原理在于为DNA实验制造不同的温度环境，使DNA变性、退火、引物链延伸，其实质为一台精密温度控制仪。其温度的准确性和稳定性、波动性直接影响DNA反应3个阶段过程中基因片段的扩增质量。但是目前国内PCR仪器的校准规程里并未对温度校准装置的响应速度及温度测量位置进行详细阐述，为此本文针对PCR仪试样环境温度的测量装置及测温位置进行探讨。

1 PCR仪简介

1.1 PCR仪简介

目前市面上PCR仪的主流方向为半导体式PCR，其内部结构示意图如图1所示：在快速导热金属质地的基座上设有多个试管孔，并由下方的半导体片进行加热制冷控温。

图1 半导体式PCR仪内部结构示意图

1.2 PCR仪校准用温度传感器

PCR仪使用的基座按孔数分有48孔、60孔、96孔，按孔的大小也分为0.2ml、0.5ml等。根据PCR仪的特殊结构，若采用一般铂电阻的形状及大小无法与基座完全接触，且粗大的铂电阻数据线使得在校准过程中带闭盖结构的PCR仪顶盖无法闭合，加强了空气对流，破坏了基座温度场分布，影响校准结果。

目前市面上主流的国外PCR温度检测装置其测量传感器使用固定测点间距及探头大小的检测系统，其普适性低，不适用于检测对象具有多样性的计量检测机构。此外，以DRIFTCON的PCR实时检测系统为例，其温度探头（如图2所示）虽能和基座试管孔完美贴合，但尺寸较大直接影响其热容值，导致热响应速度减慢，不能满足快速检测的需求，在校准PCR仪升降温速率时偏差较大。

（1） （2）

图2 BIOplastics的温度传感器图

2 温度测量

2.1 标准器装置

1）温度采集

利用本院自主研发的Vtest-1101温湿度试验设备自动检定系统的18CH温度数据采集器（如图3所示），对温度数据进行自动快速采集。

图3 温度数据采集器图

2）薄膜铂电阻

为了满足温度测量快速响应且准确可靠的测量需求，本文采用厚1mm、热触点面积1mm2的薄膜铂电阻Pt100，其具有热容小、热反应时间短、在（-40～200）℃范围内线性准确测温的特点，并能较好伸入PCR仪试管孔中，而不影响其基座的温度场。为了防止薄膜铂电阻遇水静电等一系列干扰，将其表面及引线涂上有较高的机械强度且防水耐油的漆包线漆，进而提高和稳定铂电阻引线的性能，其实物图如图4所示。

图4 薄膜铂电阻实物图

2.2 温度测量方法

1）温度测量方法1

为了让薄膜铂电阻更好的与试管孔壁面贴合，在试管孔内壁涂上一层具有高导热率的导热硅脂，并将薄膜铂电阻深入试管与基座之间，利用试管往下的力使薄膜铂电阻热触点面贴紧孔壁，最后连接采集器及上位机进行孔壁温度的测量。薄膜铂电阻测点放置位置如图5所示。

图5 方法1铂电阻测温位置示意图

2）温度测量方法2

为了防止液体在试验温度内沸腾时产生气泡，并附着温度传感器进而带来测量误差。在试管内加入2/3试管容积高传热效率、高沸点的导热油，然后将薄膜铂电阻伸入1/2液体深度，最后将其连接采集器及上位机进行试管中液体温度的测量。薄膜铂电阻测点放置位置如图6所示。

图6 方法2铂电阻测温位置示意图

PCR仪的温度偏差、均匀度、波动度分别表征试管孔的实际温度的差值、各试管实验结果的一致性及实验成功率。为了对比两种测量方法，分别对Applied Biosysterms 9700型号的一台PCR仪进行试验测试，设定仪器温度95.0℃恒温。并取图7中5个位置的试管孔进行测温，待温度示值稳定后进行温度数值采样，并对其温度偏差、均匀度、波动度进行分析，两种测量方法试验数据如下：

图7 96试管孔测温点

a）温度测量方法1（表1）：（℃）

表1

从以上数据分析可以看出基板整个空间自左而右侧温度呈现由高到低的梯度，温度偏差△Td：+0.20℃，温度均匀度△Tu：0.47℃，温度波动度△Tv：±0.15℃。

b）温度测量方法2（表2）：（℃）

表2

同样从以上数据分析可以看出，温度偏差△Td：-0.76℃，温度均匀度△Tu：0.54℃，温度波动度△Tv：±0.02℃。

对比两种PCR仪测温的方法，两种方法所测结果中方法2的温度偏差较小，并略小于显示温度；方法2的波动度也小于方法1，均匀性两种方法相差不多。方法1实测温度实质为仪器基板孔壁温度，而方法2实测温度为试管内DNA实验时的液体环境温度。在进行PCR试验时，基座温度通过试管壁传递到其试管内液体，在稳定散热情况下自基座底部到试管形成一定梯度的温度场，因此方法1所测温度略高于方法2所测温度，且方法2的所测位置的温度波动更小，其所测位置实际温度的测量也更满足DNA实验需要。

3 总结

根据PCR温度计量检测准确性和升温速率检测快速响应的需要，本文提出使用薄膜铂电阻对PCR进行温度检测；并通过提出两种测温传感器放置的位置进行温度检测试验，通过试验数据分析比较其温度偏差、波动度、均匀度说明将测温敏感点放置在试管的液体中的位置最满足DNA实验需要。

【参考文献】

[1]莫晓山，陈宪.PCR分析仪器关键技术及其相关标准制定初探[J].中国计量， 2009：74-76.

[2]张丽萍.基因扩增仪PCR仪温度校准装置的研究[D].天津：天津大学，2012.

[责任编辑：杨玉洁]