蓝莓籽不同组分抗氧化作用的比较

王　芳，康　超，李永霞，贾　强，聂　飞

(贵州省生物研究所，贵州　贵阳　550009)



蓝莓籽不同组分抗氧化作用的比较

王芳，康超，李永霞，贾强，聂飞

(贵州省生物研究所，贵州贵阳550009)

摘要：目的：为了加强蓝莓籽的综合利用开发，研究蓝莓籽不同组分的抗氧化能力。方法：对蓝莓籽的醇提取物、蓝莓籽多酚、蓝莓籽蛋白、蓝莓籽多糖进行提取分离，采用AAPH法、DPPH法对各组分进行抗氧化能力测定。结果：AAPH法测定的抗氧化能力由高到低的顺序为：蓝莓籽多糖﹥蓝莓籽蛋白≈α—VC﹥醇提取物﹥蓝莓籽多酚；DPPH法测定的清除自由基能力由高到低顺序为：蓝莓籽多酚﹥醇提取物≈α—VC﹥蓝莓籽蛋白﹥蓝莓籽多糖。结论：蓝莓籽不同组分均显示出一定的抗氧化能力，其中以蓝莓籽多糖、蓝莓籽蛋白的抗氧化能力最强，蓝莓籽多酚的清除自由基能力最强。

关键词：蓝莓籽；蓝莓籽多酚；蓝莓籽多糖；蓝莓籽蛋白；抗氧化

蓝莓(blueberry)又称越橘，属杜鹃花科(Ericaceae)越橘属 (Vaccinium.spp ) ，其果实除含有蛋白质、氨基酸、脂类、碳水化合物、维生素以及微量元素等营养素，还富含花青素、鞣花酸和紫檀芪等生物活性物质，具有改善视力、预防心脑血管疾病、降血压、 降血脂、消炎、预防和治疗癌症、改善大脑活力、强抗氧化性和自由基清除能力等作用，被世界卫生组织认为是抗氧化性最强的水果之一[1-3]。近几年，随着公众对蓝莓营养保健功能的关注，蓝莓产品的需求越来越大。

本文以现代生物活性物质分离技术，提取、分离和制备蓝莓籽醇提取物、多酚、多糖、粗蛋白等不同组分，并对不同组分进行抗氧化活性比较，为蓝莓籽的综合开发利用提供参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

蓝莓籽：新鲜蓝莓采自贵州省麻江县蓝莓果园，经发酵酿酒后取果糟渣干燥粉碎，初筛后得到蓝莓籽，再将蓝莓籽粉碎过100目筛，于-20 ℃冻藏备用；DPPH、AAPH(日本和光纯药工业株式会社，分析纯)，亚油酸(SigmaAldrich公司，分析纯)，其它试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

HH—6数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；HR2839搅拌机，珠海飞利浦家庭电器有限公司；WGT型数控超声波清洗器，深圳市威固特超声仪器有限公司；AF—610A原子荧光光谱仪，北京瑞利分析仪器有限公司；小分子透析袋，分装，进口。

1.3试验方法

1.3.1蓝莓籽醇提取物、蓝莓籽多酚、蓝莓籽多糖的制备

称取蓝莓籽粉100 g，加入9倍体积60 %乙醇水浴浸提3 h，重复两次；将醇溶性成分真空浓缩，其中一半干燥后得到蓝莓籽醇提物；另一半用等体积乙酸乙酯提取，乙酸乙酯层浓缩后干燥得蓝莓籽多酚，水层经三氯乙酸脱蛋白，加入3倍体积95 %乙醇沉淀，沉淀溶解后透析，干燥得到蓝莓籽多糖。

1.3.2蓝莓籽蛋白的制备

称取蓝莓籽粉100 g，加入40 %乙醇浸提半小时，重复三次，过滤；残渣加入0.05M Tris—HCI缓冲液，常温磁力搅拌16 h；过滤后溶液用HCl调节pH值至4.5，然后加硫酸铵至50 %饱和度沉淀蛋白，再用0.05 M Tris—HCI缓冲液溶解沉淀，透析后得到蓝莓籽粗蛋白。

1.3.3蓝莓籽多酚、多糖、蛋白质含量的测定

蓝莓籽多酚含量用酒石酸铁比色法(GB8313—87)测定。蓝莓籽提取物中的多糖含量测定按照硫酸-苯酚法测定[4]，以葡萄糖作为标准。蓝莓籽提取物中的蛋白质含量按照Lowry—Folin法测定[5]。

1.3.4蓝莓籽不同组分抗氧化活性的测定

1.3.4.1AAPH法

参考文献[6]，分别将提取的蓝莓籽多酚、蓝莓籽多糖、蓝莓籽蛋白和醇提取物制成浓度为25 μg / ml的溶液。取1 ml待测样品溶液于10 ml的具塞试管中，加入2 ml 2.51 %(W / V)的亚油酸无水乙醇溶液，4 ml 0.05 mol / L pH7.0的磷酸盐缓冲液，2 ml蒸馏水，超声波混匀。加入0.417 ml的0.1M AAPH，密闭后放在暗处并于37 ℃恒温水浴锅中保持200 min。按照硫氰酸铁法(FTC法)测定氧化程度；取0.1 ml该混合溶液，加入9.7 ml 75 %乙醇和0.1 ml 30 %硫氰酸铵，再加入0.1 ml 0.02 mol / L溶解于3.5 %盐酸中的氯化亚铁，混匀。反应 5 min后，在500 nm测定吸光度，再在 50 min、100 min 、200 min时各测定一次。空白不加抗氧化剂，相同浓度的α—VC(25 μg / ml)作为阳性对照。所有结果均为试验三次的平均值。

1.3.4.2DPPH法

参考文献[7]，DPPH用无水乙醇配成2×10-4M的溶液，置于4 ℃避光保存。蓝莓籽醇提取物、蓝莓籽多酚、蓝莓籽多糖、蓝莓籽蛋白和阳性对照品均用无水乙醇配成1 mg / ml的原液。吸取供试原液各100 μL，并分别加入了2×10-4M DPPH的溶液100 μL，然后放入96孔板的各孔中，同时以不加DPPH(以100 μL无水乙醇代替DPPH)的供试品溶液浓度作为对照以消除供试品本身颜色对测试结果的干扰，并设DPPH阴性对照(以100 μL无水乙醇代替供试品)，每组平行设4个复孔。将96孔板放入酶标仪中，震荡1 min，并于此条件下保存(室温、避光)，30 min后测定其在517 nm处的吸光度OD值，按如下公式计算供试品的自由基清除率。以样品浓度对清除率作图，求出清除率50 %时所需样品浓度，即为半清除浓度EC50。

自由基清除率=[ODDPPH· control—(ODsamp—le—ODsample control)]/ ODDPPH· control×100 %

其中：ODDPPH· control为DPPH阴性对照组OD值的平均值；

ODsample为样品组OD值的平均值；

ODsample control为样品乙醇对照组OD值的平均值。

1.4数据处理

试验数据采用平均值±标准差(n=3)，平均值之间的差异显著性采用SPSS 8.0的LSD检验法进行统计分析，若P﹤0.05，则认为差异显著；图表采用Excel2007制作。

2结果与分析

2.1蓝莓籽醇提取物、蓝莓籽多酚、蓝莓籽多糖和蓝莓籽蛋白含量测定结果

如表1所示，蓝莓籽醇提取物中蓝莓籽多酚、多糖、蛋白的含量分别为382.6±3.8 g / kg、187.1±26.5 g / kg、347.2±9.6 g / kg；按方法1.3.1提取蓝莓籽多酚其多酚类物质含量为843.6±9.8 g / kg，多糖、蛋白类物质未检出；按方法1.3.1提取的蓝莓籽多糖其糖类物质含量为403.3±6.1 g / kg，蛋白类物质的含量为32.9±3.7 g / kg，蛋白类比重低于10 %，可忽略不计，多酚类物质未检出；按方法1.3.2提取的蓝莓籽蛋白其蛋白类物质含量为521.6±16.9 g / kg，多酚类、糖类物质未检出。

表1　蓝莓籽醇提取物、蓝莓籽多酚、蓝莓籽

注： ND表示未检测出。

2.2蓝莓籽不同组分抗氧化活性

2.2.1AAPH法测定蓝莓籽醇提取物、蓝莓籽多酚、蓝莓籽多糖、蓝莓籽蛋白的抗氧化活性

AAPH法测定了蓝莓籽醇提取物、蓝莓籽多酚、蓝莓籽多糖、蓝莓籽蛋白对亚油酸过氧化反应的抗氧化能力。如图1所示，蓝莓籽不同组分均有一定的抗氧化作用，在200 min反应时间内，随时间的延长各组分的抗氧化能力呈下降趋势，其中蓝莓籽多糖显示出最高的抗氧化能力。抗氧化能力由高到低的顺序为：蓝莓籽多糖﹥蓝莓籽蛋白≈α—VC﹥醇提取物﹥蓝莓籽多酚。

图1　蓝莓籽提取物AAPH法抗氧化能力曲线图

2.2.2DPPH法测定蓝莓籽醇提取物、蓝莓籽多酚、蓝莓籽多糖、蓝莓籽蛋白的抗氧化活性

1)DPPH自由基广泛应用于评价活性物质清除自由基活性的试验中。蓝莓籽蓝莓籽醇提取物、蓝莓籽多酚、蓝莓籽多糖、蓝莓籽蛋白都对DPPH自由基清除能力呈现出剂量依赖性，在一定浓度范围内，随着活性物质浓度的增加，清除率也相应增加。

DPPH法测定了蓝莓籽醇提取物、蓝莓籽多酚、蓝莓籽多糖、蓝莓籽蛋白清除自由基活性。如图2所示，显示蓝莓籽不同组分清除DPPH自由基的动态变化曲线以及清除效果，表示蓝莓籽不同组分均有一定的抗氧化能力。其清除自由基能力由高到低顺序为：蓝莓籽多酚﹥醇提取物≈α—VC﹥蓝莓籽蛋白﹥蓝莓籽多糖。前5 min之内，各组分清除能力最强，吸光值急剧下降，特别是蓝莓籽多酚表现出比阳性对照α—VC还要强的清除DPPH自由基的能力。

图2　蓝莓籽提取物DPPH法抗氧化能力曲线图

2)根据2.2.2测定结果，进一步设计并配制五个不同浓度的样品溶液，同时以天然抗氧化剂α—VC为阳性对照，通过浓度—效应关系计算EC50值，如表2所示。

表2　蓝莓籽提取物EC50值

3结论与讨论

蓝莓籽的构成成分主要有蓝莓籽多酚(主要是儿蓝莓籽素类、黄酮类)、蓝莓籽蛋白、蓝莓籽多糖等。采用两种方法对蓝莓籽醇提取物、蓝莓籽多酚、蓝莓籽蛋白、蓝莓籽多糖进行抗氧化能力测定，其中AAPH法测定的抗氧化能力由高到低的顺序为：蓝莓籽多糖﹥蓝莓籽蛋白≈α—VC﹥醇提取物﹥蓝莓籽多酚；DPPH法测定的清除自由基能力由高到低顺序为：蓝莓籽多酚﹥醇提取物≈α—VC﹥蓝莓籽蛋白﹥蓝莓籽多糖。从测定结果可见，蓝莓籽不同组分均有一定的抗氧化能力，其中蓝莓籽多糖的抗氧化能力与对照相比有显著性差异，表现出较强的抗氧化能力。同时，蓝莓籽多酚清除自由基能力有显著性差异，清除自由基能力较强。

屈小媛等[8]对蓝莓籽油挥发性成分的GC—MS分析结果表明，其优势成分主要有姜黄烯、α—长叶蒎烯、异石竹烯、异戊酸L—薄荷酯、亚麻醇、植物类谷甾醇、苯乙醇、L—抗坏血酸—2，6—二棕榈酸酯、亚油酸乙酯、角鲨烯等活性成分，具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗衰老、降低胆固醇和血脂等作用。

本文通过抗氧化试验表明蓝莓籽多糖和蓝莓籽蛋白具有较强的抗氧化能力，蓝莓籽多酚清除自由基能力显著，蓝莓籽具有开发利用价值和前景。

参考文献【REFERENCES】

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投稿日期：2016-01-17；修回日期：2016-01-20

Comparison of antioxidant activities of different components in blueberry seeds

WANG Fang，KANG Chao，LI Yongxia，JIA Qiang，NIE Fei

(GuizhouInstituteofBiology，Guiyang550009，China)

Abstract：Objective：In order to strengthen the comprehensive utilization of blueberry seeds，the antioxidant capacities of different components in blueberry seeds were studied.The methods are：extract and separate alcohol extraction，polyphenols，protein and polysaccharide from blueberry seeds.And then，the antioxidant capacities of different components above were determined by AAPH and DPPH.The results are that the antioxidant capacities determined by AAPH from high to low order are：blueberry seed polysaccharide﹥blueberry seed protein≈α—VC﹥alcohol extraction﹥blueberry seed polyphenols.The antioxidant capacities determined by DPPH from high to low order were：blueberry seed polyphenols﹥alcohol extraction≈α—VC﹥blueberry seed protein﹥blueberry seed polysaccharide.The results show that different components in blueberry seeds occur in certain antioxidant capacities，blueberry seed polysaccharide and blueberry seed protein which has strongest antioxidant activities，and strongest activities in scavenging free radicals.

Keywords：blueberry seeds；blueberry seed polyphenols；blueberry seed polysaccharide；blueberry seed protein；antioxidant

中图分类号：TS 207.3

文献标识码：A

文章编号：1003—6563(2016)02—0015—04

*基金项目：贵州省重大专项“山地蓝莓产业关键技术研究与应用”(黔科合重大专项字[2015]6013号)；贵州科学院2013年基金项目“蓝莓贮藏期灰霉病拮抗菌株的筛选和生物学特性研究”。

作者简介：王芳(1983-)，女，硕士，助理研究员。研究方向：生物资源开发利用。

通讯作者：▲聂飞(1965-)，男，硕士，研究员。研究方向：蓝莓繁育与栽培技术研究。