蒸馏废液中金属离子对木薯淀粉液化过程的影响及优化

杨圣乾，张建华，毛忠贵，王柯

(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)



蒸馏废液中金属离子对木薯淀粉液化过程的影响及优化

杨圣乾，张建华，毛忠贵*，王柯

(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡，214122)

摘要蒸馏废液回用可有效减少酒精生产中的废水排放量，但会导致发酵结束后残糖升高。研究发现，蒸馏废液对液化过程的抑制是造成残糖升高的主要原因。文中考察了蒸馏废液中金属离子对耐高温ɑ-淀粉酶酶活及二级结构(ɑ-螺旋、β-折叠、β-转角及无规则卷曲)的影响。结果表明，在对应浓度下(与蒸馏废液中的浓度一致)，Na+(55.89 mmol/L)和K+(33.27 mmol/L)对淀粉酶酶活没有影响；Al(3+)(3.85 mmol/L)和Li+(0.98 mmol/L)对酶活有轻微抑制；Mg(2+)(7.24 mmol/L)和Ca(2+)(3.87 mmol/L)对酶活有促进作用；Fe(3+)(1.40 mmol/L)使酶活下降19.18%。淀粉酶二级结构中ɑ-螺旋含量下降可能是Fe(3+)造成酶活下降的原因。蒸馏废液中加入16mmol/L Mg(2+)可以使液化效果恢复至正常水平，并降低酒精发酵结束后的残糖含量。

关键词酒精发酵；蒸馏废液；金属离子；耐高温ɑ-淀粉酶；蛋白质二级结构

随着人们对能源需求的日益增加，燃料乙醇作为一种绿色可再生能源逐渐引起世界各国的关注[1]。木薯作为一种非粮作物，具有淀粉含量高、生产成本低等优势[2]，被认为是酒精生产的理想原料。但是酒精发酵每生产1 t乙醇就会产生7～15 t的废水[3]，这类废水COD高达60 000～100 000 mg/L，pH一般在3.8～4.5，是乙醇生产的主要污染源。

大多数的蒸馏废液综合处理方式都采用将一部分的蒸馏废液返还生产中用于拌料[4]，在减少蒸馏废液污染的同时，还可以减少工艺用水。但是大量实践证明随着蒸馏废液回用比例和批次的增加，酒精发酵残糖增加，酒度降低，原因可能是蒸馏废液中的某些物质会对酒精发酵产生抑制作用[5]。

本文在对蒸馏废液回用时，酒精发酵结束后残糖升高原因分析的基础上，考察了蒸馏废液中的金属离子对木薯淀粉液化过程的影响。详细考察了不同浓度条件下，金属离子对耐高温ɑ-淀粉酶酶活及二级结构的影响，并提出了解决方案。

1材料与方法

1.1原辅料与菌种

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)：湖北宜昌安琪酵母有限公司。

木薯：河南天冠企业集团有限公司。

酶：耐高温ɑ-淀粉酶(100 000 U/mL)和糖化酶(10 000 U/mL)，均由无锡杰能科生物工程有限公司提供。

1.2实验方法

1.2.1酒精发酵种子培养基

种子培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06，pH自然，115 ℃灭菌15 min。培养条件：摇床培养，200 r/min，30 ℃，18 h。

1.2.2液化液制备与酒精发酵

按1∶2.5(g∶mL)的比例将木薯粉(平均粒径0.45 mm)与配料水混合，用硫酸或氢氧化钠溶液将料液pH调节至5.5，加入耐高温α-淀粉酶(15 U/g木薯粉)。加热料液至100 ℃，维持30 min。降温至室温，添加去离子水以弥补液化过程水分的损失。分装至250 mL三角瓶中，灭菌(115 ℃，20 min)。降温后加入糖化酶(150 U/g木薯粉)、种子培养基(10%,v/v)和尿素(450 mg/L)启动酒精发酵。在30 ℃培养箱中静置发酵48 h。

1.2.3分析方法

还原糖测定：菲林试剂滴定法[6]。

耐高温ɑ-淀粉酶酶活测定：DNS显色法[7]。

耐高温ɑ-淀粉酶二级结构测定：圆二色谱检测(MOS-450多功能圆二色谱仪法国Bio-Logic公司)。检测条件：样品浓度0.22 mmol/L，样品池厚度0.1 cm，波长范围190～250 nm，扫描速度30 nm/min，扫描次数3次。用CD分析软件Dichroweb计算耐高温ɑ-淀粉酶中四种二级结构的百分含量[8]。

金属离子测定：火焰原子吸收光谱法。

总糖测定：料液与4% HCl按1∶9比例混匀，沸水浴2 h，冷却后，中和至中性或弱酸性，按还原糖测定方法进行检测。

酒度：HPLC法，蒸馏法。

2结果与讨论

2.1不同蒸馏废液回用比例对酒精发酵残糖量的影响

分别以0%、20%、40%、60%、80%和100%的比例将蒸馏废液回用于配料，并进行液化、糖化及酒精发酵。发酵结束后残总糖、乙醇浓度如表1所示。随着蒸馏废液回用比例的增加，发酵液中残糖量逐渐增加，酒度略有下降。蒸馏废液回用造成残糖量较高的原因可能是：一是木薯淀粉液化不彻底造成较多的淀粉等多糖残余；二是木薯淀粉液化后糖化不完全，残余较多的糊精等短链糖；三是酵母细胞对葡萄糖的利用不完全导致葡萄糖残余量较多。实验中检测了酒精发酵结束后，发酵液中残淀粉、残糊精和残还原糖的含量，结果如图1所示。

表1　不同蒸馏废液回用比例对酒精发酵残糖量和

图1　不同蒸馏废液回用比例对酒精发酵残还原糖、残糊精和残淀粉含量的影响Fig.1　Effects of different distillery waste recycling ratios on residual reducing sugar, dextrin and starch concentrations

随着回用比例增加，发酵液中残糊精和残还原糖浓度基本一致，说明蒸馏废液回用对木薯淀粉糖化过程和酵母发酵没有抑制作用；而残淀粉分别占残总糖量的65.04%、67.63%、70.20%、69.83%、71.48%和73.73%，说明木薯淀粉液化过程受到抑制是导致残总糖量较高的主要原因，并且随着蒸馏废液回用比例的增加，残淀粉的量也逐渐增加，说明蒸馏废液中的某些物质对木薯淀粉液化过程具有抑制作用。

2.2蒸馏废液中金属离子对耐高温ɑ-淀粉酶的影响

2.2.1蒸馏废液中金属离子浓度的测定

研究发现，金属离子会影响耐高温ɑ-淀粉酶的酶活力[9]。蒸馏废液中的金属离子主要来自木薯原料夹带，以及发酵液(pH 3.8～4.5)对金属材质罐体和管道的腐蚀。这些金属离子可能会使耐高温ɑ-淀粉酶钝化，从而对木薯淀粉液化过程产生抑制。自来水和蒸馏废液中主要金属离子浓度如表2所示。蒸馏废液中金属离子主要有Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Al3+、Li+等，且浓度均高于自来水对照。

表2　自来水和蒸馏废液中主要金属离子浓度

注：N.D.指未检测到。

2.2.2蒸馏废液中金属离子对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力的影响

分别研究不同金属离子浓度对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力的影响(设定去离子水中耐高温ɑ-淀粉酶酶活力为100%)，结果如图2所示。

图2 不同金属离子对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力的影响Fig. 2　Effect of different metal ions on α-amylase activity(注：Na+浓度×20倍，K+浓度×10倍，Mg2+和Li+浓度×2倍)

当Na+和K+浓度分别在140 mmol/L和70 mmol/L以内时，对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力基本没有影响，蒸馏废液中Na+和K+浓度分别为55.89 mmol/L和33.27 mmol/L，对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力没有影响。Fe3+、Al3+和Li+对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力有一定的抑制作用，其中Al3+和Li+对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力有轻微的抑制作用，Fe3+对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力的抑制作用最为显著，当Fe3+浓度达到7 mmol/L时，耐高温ɑ-淀粉酶酶活力仅有原始酶活力的78.56%。蒸馏废液中Fe3+浓度是1.40 mmol/L，对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力具有抑制作用。当Mg2+浓度在14 mmol/L以内时，Mg2+对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力具有明显的促进作用，并且随着Mg2+浓度的增加，酶活力也逐渐增加。蒸馏废液中Mg2+浓度是7.24 mmol/L，对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力具有促进作用。随着Ca2+浓度的增加，耐高温ɑ-淀粉酶酶活力呈先升高后下降的趋势，当Ca2+浓度是1 mmol/L时，酶活力最大，随着Ca2+浓度继续增加，酶活力逐渐下降。

2.2.3蒸馏废液中金属离子对耐高温ɑ-淀粉酶二级结构的影响

表3　不同金属离子对耐高温ɑ-淀粉酶二级结构的影响

注：对照组指不添加金属离子的原始耐高温ɑ-淀粉酶。

2.3蒸馏废液回用木薯淀粉液化过程优化

实验证明，蒸馏废液中的部分金属离子对木薯淀粉液化过程具有抑制作用。虽然通过增加耐高温ɑ-淀粉酶用量、升高液化温度或者延长液化时间可以改善木薯淀粉的液化效果，但是这些方式会使酒精生产成本增加较大。研究发现，有些金属离子会产生拮抗作用，一种离子的抑制作用可以通过添加另一种离子来消除[15]，因此可以通过在蒸馏废液初次回用时加入对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力具有促进作用的Mg2+，使整个循环体系中Mg2+浓度增加，消除抑制离子对耐高温ɑ-淀粉酶的钝化作用，进而减少发酵残糖量。

2.3.1Mg2+和Fe3+对耐高温ɑ-淀粉酶的共同影响

如图2所示，蒸馏废液中的Fe3+是抑制耐高温ɑ-淀粉酶酶活力的主要因素，而Mg2+对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力具有促进作用。因此在酶反应体系中分别加入0、2、4、6、8、10和12mmol/L Mg2+与1.4mmol/L Fe3+的混合溶液，检测耐高温ɑ-淀粉酶酶活力以及二级结构的变化。设定原始酶活力为100%，酶活力变化如图3所示，酶二级结构变化如表4所示。1.4 mmol/L Fe3+对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力具有明显的抑制作用，酶活力仅有原始酶活力的80.82%。随着Mg2+浓度的增加，酶活力逐渐升高，当Mg2+浓度达到8mmol/L时，酶活力恢复到最初水平，说明Mg2+可以有效地消除Fe3+对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力的抑制作用。如表4所示，当体系中只有1.4 mmol/L Fe3+时，ɑ-螺旋含量下降了24.4%，耐高温ɑ-淀粉酶二级结构由有序状态向无序状态转变；而当加入Mg2+后，ɑ-螺旋含量大幅度上升，说明耐高温ɑ-淀粉酶酶能够竞争性的与Mg2+结合，使酶活力得到恢复。

图3　Mg2+和Fe3+对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力的共同影响Fig. 3　Synergetic effect of Mg2+ and Fe3+ on α-amylase activity

Fe3+/(mmol·L-1)Mg2+/(mmol·L-1)ɑ-螺旋/%β-折叠/%β-转角/%无规则卷曲/%0034.711.423.531.81.4010.3441033.61.4256.9319.220.91.4456.73.619.320.51.46573.219.221.11.4856.63.619.320.61.410583.619.319.61.41266.68.511.613.5

2.3.2Mg2+对木薯淀粉液化效果影响

以蒸馏废液作为拌料水，并在蒸馏废液中分别加入0、4、8、12和16 mmol/L Mg2+，按料水比为1∶2.5进行拌料，之后进行液化。液化过程还原糖生成量如表5所示。随着蒸馏废液中Mg2+浓度的增加，木薯淀粉液化过程还原糖生成量也逐渐增加，当Mg2+浓度达到16 mmol/L时，木薯淀粉液化过程还原糖生成量达到自来水液化水平，说明在回用蒸馏废液中加入Mg2+可以改善木薯淀粉的液化效果。

表5　Mg2+对木薯淀粉液化过程还原糖生成量的影响

2.3.3Mg2+对不同比例蒸馏废液回用酒精发酵残糖量的影响

如表5所示，在回用蒸馏废液中加入16 mmo/L Mg2+，木薯淀粉液化效果与自来水拌料木薯淀粉液化水平相当，因此分别以0%，20%，40%，60%，80%和100%加入16 mmo/L Mg2+的回用蒸馏废液作为拌料水进行酒精发酵。发酵结果如图4和表6所示。

图4　蒸馏废液不同比例回用时，Mg2+(16mmol/L)添加对酒精发酵结束后残还原糖、残糊精和残淀粉量的影响Fig. 4　Effects of different distillery waste recycling ratios with 16 mmol/L Mg2+ on residual reducing sugar,dextrin and starch concentrations

回用比例/%020406080100乙醇/%13.7513.8613.9614.0513.9413.85

随着蒸馏废液回用比例的增加，残还原糖、残糊精和残淀粉的量基本不变，与图1相比，残还原糖和残糊精的量没有变化，而残淀粉和残总糖的量明显降低，说明在回用蒸馏废液中加入16 mmol/L Mg2+能够有效地减少酒精发酵的残糖量。如表6所示，随着蒸馏废液回用比例增加，酒精发酵乙醇生成量有一定幅度的上升，当蒸馏废液回用比例超过60%时，与低回用比例相比乙醇生成量虽有所下降但仍略高于自来水配料的酒精发酵，这可能与蒸馏废液低比例回用，一定浓度的乙酸、丙酸等小分子有机酸可以减少酒精发酵过程中甘油等副产物的合成有关。Taherzadeh等人的研究发现，当在酒精发酵体系中加入乙酸时，乙醇的产量增加，生物质和甘油产量会下降[16]；张成明等人的研究发现，丙酸可以减少酒精发酵甘油的产量[17]，说明如果残余淀粉能够得到充分利用，一定比例蒸馏废液回用能够提高酒精发酵的乙醇生成量。

3结论

蒸馏废液回用于酒精发酵过程可减少废水排放和水资源消耗，但是蒸馏废液的回用会造成发酵残糖普遍升高，进而降低原料利用率和增加生产成本。液化过程中耐高温α-淀粉酶受到蒸馏废液中金属离子的抑制是造成该问题的主要原因。研究证明，蒸馏废液中Fe3+是抑制耐高温α-淀粉酶活力的主要物质；另一方面，Mg2+能够提高耐高温α-淀粉酶活力。在蒸馏废液中添加Mg2+可以有效消除Fe3+等对耐高温ɑ-淀粉酶酶活力的抑制作用。当Mg2+浓度为16mmol/L时，液化过程还原糖生成量恢复至自来水配料时的液化水平，酒精发酵醪中残糖量降低，乙醇生成量增加。

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Effect of metal ion in distillery waste on cassava starch lique faction and its optimization

YANG Sheng-qian，ZHANG Jian-hua，MAO Zhong-gui*，WANG Ke

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

ABSTRACTRecycling distillery waste in ethanol fermentation can effectively reduce discharge of waste water. However this results in increased residual sugar concentration. It has been found that inhibition of the liquefaction process by distillery waste caused the increased residual sugar concentration. Effects of metal ions in the distillery waste on the activity and secondary structure of α-amylase were studied herein. Results showed that 55.89 mmol/L Na+ and 33.27mmol/L K+ had no effect on the α-amylase activity. 3.85 mmol/L Al(3+) and 0.98 mmol/L Li+ had a slight inhibition on α-amylase activity. 7.24 mmol/L Mg(2+) and 3.87mmol/L Ca(2+) could stimulate the α-amylase activity. α-amylase was mainly inhibited by Fe(3+) and the enzyme activity was reduced by 19.18% with 1.4mmol/L Fe(3+). α-helical decrease caused by Fe(3+) maybe resulted in inhibition of ɑ-amylase activity. Meanwhile, addition of 16 mmol/L Mg(2+) to the distillery waste could promote the liquefaction of starch and decrease the residual sugar concentration.

Key wordsethanol fermentation；distillery waste；recycling；metal ion；ɑ-amylase；secondary structure

收稿日期：2015-09-14，改回日期：2015-10-15

基金项目：苏州市科技支撑计划(SS201412)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602010

第一作者：硕士研究生(毛贵忠教授为通讯作者,E-mail:maozg@vip.163.com)。