大黄与甘草合用对肠功能衰竭大鼠炎性因子的影响研究

徐 鑫，孟 柠，俞毅君，胡铭荣

·论著·

大黄与甘草合用对肠功能衰竭大鼠炎性因子的影响研究

徐 鑫，孟 柠，俞毅君，胡铭荣

310015浙江省杭州市，杭州师范大学附属医院普外科

【摘要】目的探讨大黄与甘草合用对肠功能衰竭大鼠炎性因子的影响以及作用机制。方法按随机、双盲、平行对照试验设计，2015年6—8月选取SFP级SD大鼠60只，采用随机数字表法分成空白对照组、模型组、大黄组、甘草组、合用组、标准品组，每组10只。模型组、大黄组、甘草组、合用组、标准品组大鼠采用乙酸诱导形成肠功能衰竭模型。造模成功后，大黄组、甘草组、合用组大鼠分别给予5 g/kg大黄、甘草、大黄和甘草溶液灌胃；标准品组大鼠给予40 mg/kg大黄素和甘草酸标准品溶液灌胃；空白对照组和模型组大鼠给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。7 d后，采用苏木素-伊红(HE)染色观察结肠组织形态变化。评价疾病活动指数(DAI)、大体形态损伤评分和组织学损伤评分，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测大鼠血清及结肠组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素(IL)-6 、IL-8 表达水平。结果与空白对照组比较，模型组、大黄组、甘草组、合用组、标准品组大鼠DAI、大体形态损伤评分及组织学损伤评分升高(P<0.05)；与模型组比较，大黄组、合用组、标准品组大鼠DAI、大体形态损伤评分及组织学损伤评分降低，甘草组大鼠DAI降低(P<0.05)；与大黄组比较，甘草组大鼠DAI、大体形态损伤评分及组织学损伤评分升高，合用组大鼠DAI及组织学损伤评分降低(P<0.05)；与甘草组比较，合用组、标准品组大鼠DAI、大体形态损伤评分及组织学损伤评分降低(P<0.05)；与合用组比较，标准品组大鼠DAI及组织学损伤评分升高(P<0.05)。与空白对照组比较，模型组、大黄组、甘草组、合用组、标准品组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8 表达水平升高(P<0.05)；与模型组比较，大黄组、甘草组、合用组、标准品组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8 表达水平降低(P<0.05)。与空白对照组比较，模型组、大黄组、甘草组、合用组、标准品组大鼠结肠组织TNF-α、IL-6、IL-8 表达水平升高(P<0.05)；与模型组和甘草组比较，大黄组、合用组、标准品组大鼠结肠组织TNF-α、IL-6、IL-8 表达水平降低(P<0.05)。结论大黄与甘草合用对肠功能衰竭大鼠具有协同抗炎作用，其主要作用的物质基础为大黄素和甘草酸。

【关键词】肠功能衰竭；大黄；甘草；炎症趋化因子类

徐鑫，孟柠，俞毅君，等.大黄与甘草合用对肠功能衰竭大鼠炎性因子的影响研究[J].中国全科医学，2016，19(15)：1824-1827.[www.chinagp.net]

Xu X,Meng N,Yu YJ,et al.Effect of the combined use of rheum and liquorice on inflammatory factors in rats with intestinal function failure[J].Chinese General Practice，2016，19(15)：1824-1827.

肠功能衰竭简称肠衰竭，是指机体受到创伤、感染、失血、颅脑损伤等外界严重刺激时所表现出的强烈的应激反应，在机体的非特异性防御系统中起重要作用，因此肠道也被称为应激器官的中心[1]。肠衰竭患者普遍丧失或者即将丧失自主营养性，肠道功能紊乱，从而出现腹胀、呕吐、胃肠蠕动变缓甚至停止等临床表现，而且一旦发生预后较差，增加临床病死率。肠衰竭的防治研究已成为当前医学领域中的一个重要研究课题[2]。现代医学通过肠外营养、药物治疗、手术治疗肠衰竭，存在一定局限性[3]。近年来中医药以其整体调节以及多靶点治疗等优势引起人们的注意，使中医药在治疗肠衰竭领域中有了广阔的应用前景[4]。本研究通过建立肠衰竭大鼠的动物模型，观察大黄与甘草合用对血清及结肠组织中炎性因子的影响，探讨大黄与甘草合用治疗肠衰竭的机制，从而为中药复方治疗肠衰竭提供依据。

1材料与方法

1.1药品与试剂大黄饮片和甘草饮片购自北京同仁堂(亳州)饮片有限责任公司，大黄素和甘草酸标准品购自中国药品生物制品检验所，冰乙酸购自美国Sigma 公司，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素(IL)-6、IL-8 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自瑞士Roche 公司。

1.2主要仪器Milli-Q超纯水仪购自美国Millipore公司；酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3实验动物2015年6—8月选取SPF级SD大鼠60只，雌性，4～5周龄，体质量(220±15) g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK (京) 2009-0012。动物饲养于23～26 ℃且12 h自动循环熄灯的标准动物房中，自由饮水和饮食，按随机、双盲、平行对照试验设计。

1.4样品制备取大黄饮片10 g，粉碎后置于100 ml水中，超声溶解，提取上清液，提取液过0.22 μm微孔滤膜后，减压浓缩，再用10 ml水复溶，用于动物给药，甘草饮片的处理方法与大黄饮片相同。另外，分别取大黄饮片和甘草饮片各10 g，粉碎后置于100 ml水中，超声溶解，提取上清液，过滤后浓缩，复溶于10 ml水中，用于动物给药。取大黄素和甘草酸标准品100 mg，溶于1 ml纯水中，超声溶解，得到0.1 g/ml母液，按照40 mg/kg 给药。

1.5分组及肠衰竭模型的建立采用随机数字表法将大鼠分成空白对照组、模型组、大黄组、甘草组、合用组、标准品组，每组10只。模型组、大黄组、甘草组、合用组、标准品组大鼠经过禁食不禁水24 h后，用戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，用聚乙烯导管从肛门插入结肠腔8 cm，将10%冰乙酸1 ml注入肠腔中。30 s后，用0.9%氯化钠溶液冲洗2次[5]。根据疾病活动指数(DAI)及大体形态损伤评分高于空白对照组判断造模成功后，大黄组、甘草组、合用组大鼠分别给予5 g/kg大黄、甘草、大黄和甘草溶液灌胃，2次/d，共1周；标准品组大鼠给予40 mg/kg大黄素和甘草酸标准品溶液灌胃，2次/d，共1周；空白对照组和模型组大鼠给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃，2次/d，共1周。

1.6标本采集和处理造模成功并给药1周后，将大鼠麻醉，称重，心脏采血4 ml，置于干燥的无菌试管中，室温静置，待其自然凝固收缩后，37 ℃水浴20 min。将血液6 000 r/min离心5 min(离心半径6 cm)，吸取上清液，-20 ℃保存，备用。采血后处死大鼠，取其结肠，沿纵轴切开，用预冷的0.9%氯化钠溶液冲洗5次，组织匀浆。将组织液6 000 r/min离心5 min(离心半径6 cm)，吸取上清液，-20 ℃保存，备用。

1.7结肠炎症的组织形态评价用甲醛将大鼠部分结肠固定，石蜡包埋之后切片，采用苏木素-伊红(HE)染色后观察组织形态变化。采用DAI、大体形态损伤评分和组织学损伤评分评价结肠炎症。

1.8血清及结肠组织中TNF-α、IL-6 、IL-8 表达水平应用TNF-α、IL-6、IL-8 ELISA试剂盒，将标准品用稀释液倍比稀释，酶标仪测定450 nm波长下各孔吸光度(OD值)。以标准品浓度的对数为横坐标、测定的OD值为纵坐标做出标准曲线，计算待测样品浓度[6]。

2结果

2.1组织形态评价处死大鼠，打开腹腔后，模型组、大黄组、甘草组、合用组、标准品组大鼠可见结肠的肠壁已经明显肿胀、充血；局部有溃烂、明显的出血点，并可找到新生的溃疡灶。6组大鼠DAI、大体形态损伤评分及组织学损伤评分比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中与空白对照组比较，模型组、大黄组、甘草组、合用组、标准品组大鼠DAI、大体形态损伤评分及组织学损伤评分升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，大黄组、合用组、标准品组大鼠DAI、大体形态损伤评分及组织学损伤评分降低，甘草组大鼠DAI降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与大黄组比较，甘草组大鼠DAI、大体形态损伤评分及组织学损伤评分升高，合用组大鼠DAI及组织学损伤评分降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与甘草组比较，合用组、标准品组大鼠DAI、大体形态损伤评分及组织学损伤评分降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与合用组比较，标准品组大鼠DAI及组织学损伤评分升高，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.26组大鼠血清及结肠组织TNF-α、IL-6、IL-8 表达水平比较6组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8 表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中与空白对照组比较，模型组、大黄组、甘草组、合用组、标准品组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8 表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，大黄组、甘草组、合用组、标准品组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8 表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

6组大鼠结肠组织TNF-α、IL-6、IL-8 表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中与空白对照组比较，模型组、大黄组、甘草组、合用组、标准品组大鼠结肠组织TNF-α、IL-6、IL-8 表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组和甘草组比较，大黄组、合用组、标准品组大鼠结肠组织TNF-α、IL-6、IL-8 表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

3讨论

本研究采用大黄、甘草单用以及大黄与甘草合用治疗肠衰竭模型大鼠，结肠炎症的组织形态评价证实，大黄与甘草合用可以缓解肠衰竭。抗炎活性的筛选发现，大黄和大黄与甘草合用对血清中3种炎性因子的表达有较强的抑制作用，其中大黄与甘草合用的效果更强，进而又对结肠组织中3种炎性因子的抑制进行了评价，进一步证明甘草的加入使大黄能更好地抑制肠衰竭的炎性反应。

大黄具有泻下攻积、解毒、清热泻火、活血祛瘀之功效，现代药理学研究证实，其具有建立肠道屏障、促进大肠蠕动、调节肠道菌群和防治微血栓形成的作用，对降低肠衰竭患者病死率具有重要意义[7]。但是大黄同样具有很强的松弛括约肌、促进胆汁分泌、抑制胰酶分泌等不良反应，对于体质极端衰弱的肠衰竭患者极为不利[8]，因此需要找到与大黄合用的中药以降低大黄的用量，并增强大黄缓解肠衰竭的作用。大黄和甘草发挥药效的主要物质基础为其中的大黄素和甘草酸[9-10]，本研究进一步评价大黄素与甘草酸合用对肠衰竭大鼠体内炎性因子的影响，发现相同浓度的大黄素与甘草酸合用与大黄与甘草合用的抗炎活性比较接近，但还是略有降低，说明大黄与甘草中起联合抗炎作用的主要成分就是大黄素和甘草酸，其他成分可以增强其抗炎作用。

表16组大鼠DAI、大体形态损伤评分及组织学损伤评分比较

Table 1Comparison of DAI,gross morphological damage score and histological injury score among the 6 groups

组别只数DAI大体形态损伤评分(分)组织学损伤评分(分)空白对照组101.0±0.70.9±0.71.2±0.6模型组109.1±1.2a9.5±1.6a8.9±0.7a大黄组104.2±0.9ab3.8±0.4ab4.1±0.6ab甘草组108.1±0.9abc9.3±0.7ac8.6±0.9ac合用组103.1±0.4abcd3.2±0.4abd3.0±0.3abcd标准品组103.5±0.7abde3.4±0.6abd3.6±0.7abdeF值124.2064.68315.34P值<0.001<0.001<0.001

注：DAI=疾病活动指数；与空白对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与大黄组比较，cP<0.05；与甘草组比较，dP<0.05；与合用组比较，eP<0.05

表2　6组大鼠血清及结肠组织TNF-α、IL-6、IL-8 表达水平比较

注：TNF-α=肿瘤坏死因子α，IL-6=白介素6，IL-8=白介素8；与空白对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与甘草组比较，cP<0.05

由于肠衰竭的病情进展较快，发病机制尚不明确，至今尚未发现特异的致病因素和致病因子，因此很难构建出完美的模拟肠衰竭的动物模型。本研究所构建的肠衰竭动物模型类似于人类的肠道病理改变，病程也与人类最相近，构建的过程简便、重现性高、经济可行。因此可以应用于急、慢性肠衰竭的研究，使肠衰竭的治疗研究能够顺利地进行。目前认为，TNF-α、IL-6诱发的炎性反应很大程度上是通过诱导以IL-8为代表的肠衰竭趋化因子的产生而实现的，TNF-α与IL-6及IL-8之间有一定的关联性，TNF-α可诱导IL-6和IL-8产生[5]。因此，TNF-α、IL-6、IL-8是其中重要的细胞因子和趋化因子，由淋巴细胞、中性粒细胞以及巨噬细胞在外界刺激作用下被激活而释放，可直接启动炎性反应或通过刺激其他炎性递质的释放，触发级联反应，从而形成广泛炎症和以血清炎性因子表达升高为特点的全身性炎性反应[11]。肠衰竭发生时，上述促炎细胞因子产生了共同的致炎作用，使肠道细胞产生炎性，过氧化物和溶酶体酶释放增多，一氧化氮(NO)合成酶活性增高，合成大量NO，增强自然杀伤细胞(NK细胞)的细胞毒性，加速肠衰竭的进程[12]。故而肠衰竭患者的抗炎治疗方式在此类疾病的治疗中占有重要地位。

综上所述，本研究证实大黄与甘草合用对肠衰竭大鼠具有抗炎作用，可以有效缓解症状，证明了复方配伍具有能够协同增效抵抗肠衰竭的特点，为指导临床用药提供了理论依据。但是，由于大鼠肠衰竭模型的构建步骤较为繁琐和漫长，模型的评价缺乏有效的客观实验依据，今后应该在模型的优化方面进一步展开研究。

作者贡献：徐鑫进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；孟柠进行实验实施和模型评估；俞毅君和胡铭荣负责资料收集及数据处理。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：陈素芳)

Effect of the Combined Use of Rheum and Liquorice on Inflammatory Factors in Rats With Intestinal Function Failure

XUXin,MENGNing,YUYi-jun,etal.

DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedHospitalofHangzhouNormalUniversity,Hangzhou310015,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of the combined use of rheum and liquorice on intestinal function failure and its mechanism.MethodsIn this random,double-blind,parallel and control trial,we selected 60 SPF rats from June to August in 2015 and divided them into six groups,which were blank control group,model group,rheum group,liquorice group,combination group and standard group,by random number table methods and with 10 rats in each group.Rats in model group,rheum group,liquorice group,combination group and standard group were built as intestinal function failure models induced by acetic acid.After model building was completed,rheum group,liquorice group and combination group were respectively given rheum,liquorice and the two together by 5 g/kg;standard group was given gavage with rheum emodin-glycyrrhizic acid by 40 mg/kg;blank control group and model group were given gavage with 0.9% sodium chloride of the same amount.Seven days later,hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the morphological changes of colon tissues.Disease activity index(DAI)，gross morphological damage score and histological injury score were evaluated,and ELISA method was used to detect the expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-8 in serum and colon tissues.ResultsModel group,rheum group,liquorice group,combination group and standard group were higher in DAI,gross morphological damage score and histological injury score compared with blank control group(P<0.05);compared with model group,rheum group,combination group and standard group were lower in DAI,gross morphological damage score and histological injury score,liquorice group was lwoer in DAI(P<0.05);compared with rheum group,liquorice group was higher in DAI,gross morphological damage score and histological injury score and combination group was lower in DAI and histological injury score (P<0.05);combination group and standard group were lower in DAI,gross morphological damage score and histological injury score compared with liquorice group(P<0.05);compared with combination group,standard group was higher in DAI and histological injury score (P<0.05).Model group,rheum group,liquorice group,combination group and standard group were higher in the expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-8 in serum than those of blank control group (P<0.05);the expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-8 in serum of rheum group,liquorice group,combination group and standard group were lower than those of model group(P<0.05).Model group,rheum group,liquorice group,combination group and standard group were higher in the expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-8 in colon tissues than those of blank control group (P<0.05);rheum group,combination group and standard group were lower in the expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-8 in colon tissues compared with model group and liquorice group(P<0.05).ConclusionThe combined use of rhubarb and licorice has synergy anti-inflammatory effects on rats with intestinal function failure,and rheum emodin and glycyrrhizic acid are the substance basis of its major effect.

【Key words】Intestinal function failure；Rheum officinale；Glycyrrhiza uralensis；Chemokines

基金项目：浙江省科技计划项目(2014C37031)

通信作者：徐鑫，310015浙江省杭州市，杭州师范大学附属医院普外科；E-mail:15268536059@163.com

【中图分类号】R 574

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.15.017

(收稿日期：2015-08-21；修回日期：2016-01-12)

·中医·中西医结合研究·