自体树突状细胞回输治疗HBeAg阳性慢性乙型病毒性肝炎32例

梁凤萍 郑其进 黎锦亮

自体树突状细胞回输治疗HBeAg阳性慢性乙型病毒性肝炎32例

梁凤萍 郑其进 黎锦亮

目的 探索自体树突状细胞回输治疗HBeAg阳性慢性乙型病毒性肝炎的疗效。方法 32例CHB患者，收集外周血，经致敏后制备成熟DC疫苗，分6次回输(每月1次)，监测并随访肝功、病毒标志物、HBV DNA及观察不良反应。结果 27例CHB患者发生了应答，总有效率84.38%，HBsAg转阴率3.13%，HBeAg转阴率68.75%，HBeAb转阳率31.25%，DNA拷贝数量下降102.87±0.23(P<0.01)，ALT、AST与治疗前对比差异有统计学意义(P<0.01)。治疗过程中只出现1例不良反应。结论 自体树突状细胞回输治疗HBeAg阳性慢性乙型病毒性肝炎有效且安全。

树突状细胞; HBeAg阳性; 慢性乙型病毒性肝炎

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是严重威胁我国人民健康和生命的传染病，我国现有慢性HBV感染者约9300万例[1]。一般在CHB的标本中能检测到HBeAg，HBeAg在血行中接触胸腺，能抑制T细胞功能，导致HBV复制活跃，传染性大。因此，恢复或增强T细胞功能成了治疗CHB的重点，而具有较强抗原提呈功能的树突状细胞(dendritic cells，DC)可被致敏后诱导成特异性T细胞，特异性杀伤表达HBsAg的靶细胞，特别是HBeAg阳性的表达HBsAg的靶细胞，这一功能恰好满足上述要求。然而，CHB通常表现为DC功能缺陷，发挥DC强大的主动免疫的治疗有望成为治疗CHB的重要手段之一[2]。本研究收集本院2014年10月～2016年3月32例接受自体DC回输治疗的CHB患者进行回顾性分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集本院2014年10月～2016年3月接受自体DC回输治疗的CHB患者32例。患者年龄20～54岁，平均(32±3.3)岁，病程2～10年，平均6.5年，其中男18例，女14例。

1.2 诊断及纳入标准

参照《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)[3]的诊断标准，符合HBsAg(+)，HBeAg(+)，HBV DNA>1.0×105拷贝/ml持续半年以上，反复40 U/L

1.3 治疗方法

1.3.1 试剂与器材 GT-T551培养基(TAKARA公司)、Ficoll(北京同立海源生物)、PBS(Hyclone)、Human IL-4(peproTech公司)、Human GM-CSF(peproTech公司)、Human TNF-α(peproTech公司)；低温低速离心机(Thermo)、倒置显微镜(olympus)、二氧化碳培养箱(Thermo)、电动移液器(Thermo)。

1.3.2 方法 总方法：采外周血，离心得到单个核细胞，即DC前体细胞，添加重组人粒-巨嗜细胞集落细胞刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)行体外扩增，鉴别培养7天，经HBsAg致敏后获得成熟的DC。

具体步骤：①采患者抗凝外周血10 ml，离心(2000 rpm×20 min)，收集上层血浆于56 ℃、30 min灭活；②将底层沉淀的血液与PBS按1∶2比例充分混匀后缓慢加入Ficoll分离液离心(2500 rpm×30 min)；③轻轻吸取白雾层细胞(单个核细胞)至另一离心管中，加PBS混匀后离心(1500 rpm×10 min)；④弃上清，加PBS混匀后离心(1200 rpm×10 min)；⑤重复上一步；⑥弃上清，收集细胞，加含2%自体血浆GT-T551培养基调整细胞浓度(2～4)×106个/ml，接种于培养瓶中，孵育4 h以上；⑦轻轻吸去上层悬浮细胞，补充新鲜培养基、IL-4(400 U/ml)、GM-CSF(1000 U/ml)。⑧第3天半量换液。⑨第5天去旧培养基，加入新鲜培养基、IL-4(400 U/ml)、GM-CSF(1000 U/ml)、TNF-α(800 U/ml)。⑩第7～10天，收获成熟的DC细胞(下图)。

图1 第7天,显微镜100× 图2 第7天,显微镜200×

于第8～11天开始采2 ml DC悬液(DC数量为(1.0～3.0)×106个)加入10 ml生理盐水中，于左右腹股沟交替皮下注射。1个月1次，3次为1疗程，共治疗2疗程，治疗前及每疗程结束后复查肝功能、乙肝两对半、乙肝DNA定量并观察是否出现不良反应。随访3个月。

1.4 观察指标

于治疗前、每疗程结束后、回输后3个月检测ALT、AST、HBsAg、HBeAg、抗-HBe、HBV DNA；并观察不良反应的发生。

1.5 疗效评价

参照《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)[3]：

①完全应答(显效)：ALT、AST恢复正常，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA 转阴。

②部分应答(有效)：ALT、AST恢复正常，HBsAg无变化，出现HBeAg/抗-HBe血清转换及HBV-DNA下降 50%。

③无应答(无效)：治疗前后无明显变化。

④病毒反跳(复发)：HBV DNA转阴后又升高>1.0×105拷贝/ml，伴有或不伴有ALT升高。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各时间段肝功能指标变化

见表1。

表1 各时间段肝功能指标变化 ±s,U/L)

注：与治疗前对比，1)P>0.05，2)P值<0.05，3)P<0.01；1)P>0.05，2)P值<0.05，3)P<0.01

由表1得知，ALT与AST于第2疗程始与治疗前对比P值<0.05，特别是回输后第3月与治疗前对比P<0.01，差异具有统计学意义。表明自体DC回输对CHB患者肝功有改善作用。

2.2 各时间段病毒血清标志物的变化

见表2。

表2 各时间段病毒血清标志物的变化 n(%)

表2显示回输后各监测时间CHB患者的病毒血清标志物逐渐出现应答，其中回输后第3个月，HBsAg转阴1例，HBeAg转阴22例，HBeAb转阳10例。

2.3 各时间段HBV DNA的变化

见表3。

nDNA定量治疗前326.12±1.03第1疗程325.36±1.101)第2疗程323.38±0.372)回输后第3月322.87±0.233)

注：与治疗前对比，1)P>0.05，2)P<0.05，3)P<0.01

表3可见接受自体DC回输后各时间段的HBV DNA水平逐渐下降，与治疗前对比P<0.05，其中回输后第3月与治疗前对比P<0.01，具有统计学意义。因此，可知自体DC回输能逐渐降低CHB患者的HBV DNA量。

2.4 回输后疗效评价

见表4。表5显示回输DC随访3个月后进行疗效跟踪及评价，可知随访结束后有应答(完全应答+部分应答)27例，总有效率达84.38%。其中所有病例中并未出现复发现象。

表4 回输后疗效评价 n(%)

2.5 不良反应记录

于第一疗程的第二次回输后出现1例发热病例，当时最高体温37.8℃，无其余不适，查血尿常规、肾功能等正常，未予处理，观察12小时后体温逐渐降至正常。下次回输未见明显不适直至完成2疗程。

3 讨论

乙型肝炎病毒(HBV)属少见的嗜肝DNA病毒科，主要经血液(如不安全注射等)、母婴及性接触传播，其中母婴传播是造成HBV慢性化的最主要原因，因此，婴幼儿接种乙肝疫苗能有效控制CHB的传播[4]。HBV感染呈世界性流行，与肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌的发生密切相关[5]。分免疫耐受期、免疫清除期、非活动或低(非)复制期和再活动期。其中，免疫耐受期-免疫清除期通常表现为ALT、AST的升高、HBsAg和HBeAg阳性、HBV DNA拷贝数量大于105～107，为进行有针对性的免疫治疗的重要的过渡期，有效的治疗可很好的抑制病毒复制、延缓疾病进程。目前治疗方法要包括抗病毒、免疫调节、抗炎和抗氧化、抗纤维化等治疗，其中保肝、抗病毒治疗是关键，但保肝药在临床选择上越来越具趋向性，疗效显著的为首选，但价格昂贵[6]；但抗病毒药物不良反应较大且疗程长，在临床工作弊端逐渐暴露。目前，免疫疗法逐渐得到青睐，有望成为治疗CHB的重要新手段。

树突状细胞(DC)起源于CD34+造血祖细胞，是具有最强大的专职抗原提呈细胞(anti-gen-pressenting cell，APC)。DC在体内数量较少，外周血中DC更不足PBMc的1%，但它有着较强的迁移能力及摄取、加工抗原能力，再者，成熟的DC能有效激活初始型T淋巴细胞，并能启动、调控并维持免疫应答。肝脏中的DC主要位于中央静脉和门脉区，含量极少，约占人体内总DC的10%[7]。DC在CHB发病过程中起着重要作用，在早期免疫中，成熟的DC启动体液免疫和特异性抗原细胞免疫；在适应性免疫中，DC细胞首先识别抗HBV免疫，将处理后的多肽呈递给CD8+T细胞和CD4+T细胞，从而抑制或清除肝细胞内HBV或通过特异性细胞毒作用直接杀伤靶细胞。据研究表明，CHB 患者体内DC数量和功能的缺陷可能是长期处于带毒状态的机制之一[8]。因此，恢复DC细胞的功能或刺激DC细胞发挥强大的抗原呈递功能，直接或间接地抑制HBV复制是至今免疫疗法的思路之一。

鉴于DC的强大功能，较多学者进行了DC疫苗制备的研究，目前多采用外周血离心分离，并经致敏后诱导，控制DC成熟状态，从而得到合适的DC疫苗。此技术逐渐成熟、简单易行，使得DC疫苗成为新一代治疗性疫苗的代表，在肿瘤免疫、乙肝免疫、移植免疫等领域中发挥着重要作用[9-10]。本研究通过CHB患者外周血提取DC细胞并回输，即用自体DC疫苗治疗CHB，结果显示在肝功能变化方面，ALT、AST逐渐改善或无进行性升高，甚至恢复正常；在病毒标志物变化方面，HBsAg转阴出现1例，HBeAg转阴22例，HBeAb转阳10例；在HBV DNA变化方面亦显示出较高的阴转率；整过研究过程中，不良反应少见，只于第1疗程发生1例发热，体温37.8℃，未经处理12小时内降至正常，未对其后回输造成中断或影响，安全性较高。综上，32例CHB患者研究中，完全应答率为3.13%，部分应答率为81.25%，无应答为15.63%，病毒反跳为0，表明自体DC回输治疗CHB有良好效果。

对于本研究，存在以下不足：随访时间不足，后续病情及不良反应不明确；尚未制定进一步治疗方案；未明确HBeAg阴性CHB患者适用价值；回顾性分析，难以设定对照组。等等。随着DC的研究逐渐深入、透彻，DC的利用方式越充分及价值越高，DC疫苗的制备技术逐渐成熟，利用DC疫苗防治CHB以后必然有着不可或缺的地位。

[1] 张春梅,刘涛.乙型病毒性肝炎的治疗进展[J].牡丹江医学院学报,2015,36(1):87-91.

[2] 冯晓霞,王磊等. 树突状细胞在慢性乙型肝炎发病中的研究进展[J].实用肝脏病杂志,2009,12(2):144-147.

[3] 中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会,慢性乙型肝炎防治指南[J].中华肝脏病杂志,2015,23(12):888-905.

[4] 鲁 芳,黎哲程,等.婴幼儿接种乙肝疫苗的临床价值[J].现代医院,2015,15(5):153-154.

[5] 戴明佳,冷雪君.《2015年世界卫生组织慢性乙型肝炎病毒感染预防、关怀和治疗指南》解读：慢性乙型肝炎的抗病毒治疗策略比较[J].临床肝胆病杂志,2015,31(7):1004-1007.

[6] 饶 媚,蒋建清,等.某院保肝药临床应用情况分析[J].现代医院,2014,14(2):72-79.

[7] 王茂鹏,杜寿文,等. 人树突状细胞分离与鉴定最新研究进展[J].中国免疫学杂志,2012,10(29):1093-1097.

[8] 张新宁,刘 荣,等. 浆细胞样树突状细胞在肝脏疾病中的作用[J]. 中华临床医师杂志,2014,8(8):1550-1560.

[9] 刘 星,靳风烁. 树突状细胞研究新进展[J].国际泌尿系统杂志,2012,32(5):659-662.

[10]汪 英,李锡春.肿瘤树突状细胞疫苗研究进展[J].国际医药卫生导报,2015,21(15):2101-2103.

R512.6+2

A

10.3969/j.issn.1671-332X.2016.10.012

梁凤萍 郑其进 黎锦亮 ： 广州中医药大学祈福医院 广东广州 510000