高速逆流色谱分离纯化野菊花中蒙花苷和木犀草素

王维娜 余琦

摘 要：目的 以野菊花的头状花序为原料，建立有机溶剂-高速逆流色谱法（HSCCC）分离纯化野菊花中蒙花苷和木犀草素的方法。方法 野菊花醇提物先经过乙酸乙酯萃取初步分离，富集目标化合物。然后，以乙酸乙酯-正丁醇-水（5∶1∶5）为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，流速5 mL/min，检测波长340 nm，利用半制备型HSCCC分离纯化蒙花苷和木犀草素。结果 经过乙酸乙酯萃取富集-高速逆流色谱法分离后，一次性得到蒙花苷和木犀草素，经HPLC检测其纯度分别为97.5%和98.4%。经1H-NMR和13C-NMR鉴定结构为蒙花苷和木犀草素。结论 该研究为简便，高效地制备野菊花中蒙花苷和木犀草素提供了参考。

关键词：高速逆流色谱 野菊花 蒙花苷 木犀草素

中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2016）01（a）-0159-02

野菊花（Chrysanthemi Indici Flos）系菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum L.）的干燥头状花序，味苦、辛，性凉，清热解毒，疏风平肝，用于疔疮、痈肿、丹毒，风热感冒、咽喉肿痛、高血压眩晕、头痛等病症，为临床常用中药。野菊花主要含黄酮类、萜类及挥发油类成分，其中蒙花苷和木犀草素是野菊花总黄酮中含量较高的代表性成分，同时，蒙花苷是我国2010和2015版药典规定的野菊花药材的质控指标。现代研究发现蒙花苷和木犀草素具有抗缺氧、抗不良刺激、抗疲劳、双向调节机体、抑制血糖升高和影响学习记忆等多种作用。由此可见，目标成分的开发具有广泛商业价值。

该实验购买市售野菊花药材，经乙酸乙酯萃取得到粗提取，以此粗提物经HSCCC一步分离得到蒙花苷和木犀草素，纯度均高于97.0%，为蒙花苷和木犀草素的开发制备提供了一种快速实用的新方法。目前，尚未见HSCCC分离制备野菊花中蒙花苷和木犀草素的相关报道。

1 仪器与材料

TBE-300C型高速逆流色谱仪、TBP-5002恒流泵和TBD-2000紫外检测仪（上海同田生物技术股份有限公司）；DC-0506恒温槽（上海恒平科学仪器有限公司）；HITACHI 高效液相色谱仪，色谱柱为Boston Crest C18柱；DPX-400型超导核磁共振波谱仪（瑞典Bruker）；QP-5000质谱（日本岛津公司）。

野菊花粗提物的制备用工业酒精，HSCCC分离所用乙酸乙酯、正丁醇等溶剂均为分析纯，HPLC所用乙腈为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；中药材野菊花（批号20140902），购于亳州药材市场，由上海中药现代制剂技术工程研究中心张继全教授鉴定为野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序，并留样保存。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Boston Crest C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相为乙腈：水（25：75）等度洗脱；检测波长为334 nm；柱温为30℃；流速为1.0 mL/min。

2.2 样品制备

称取干燥的野菊花药材粉末500 g，以70%乙醇为提取溶剂，料液比1∶8，加热回流提取3次，每次1 h，过滤，合并滤液并减压浓缩干燥得到214 g浸膏。取浸膏30 g，用水混悬，依次用正己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收萃取液，干燥得到3个组分。经HPLC检测发现乙酸乙酯部位富含蒙花苷和木犀草素，将其减压干燥，得到4 g粗提物，用于HSCCC进一步分离纯化。

2.3 HSCCC分离制备

2.3.1 HSCCC溶剂体系的选择

选择合适的两相溶剂系统是HSCCC成功分离的关键所在。该实验参考目标物质的极性大小，选择合适的溶剂体系范围，并通过具体测定K值来选择最佳溶剂体系。将不同溶剂系统按不同比例配制，摇匀并静置分层后，取适量粗提物用等体积的上下相充分混合溶解后，静置分层。各取10μL上，下相进行HPLC检测，上相峰面积为A1，下相峰面积为A2，则K=A1/A2。

2.3.2 溶剂体系及样品溶液的配制

在分液漏斗中配制乙酸乙酯/正丁醇/水（5∶1∶5，v/v）两相溶剂体系，充分振摇后室温静置分层，使用前将上下相分离，超声脱气20 min，待用。称取500 mg乙酸乙酯萃取物，用溶剂体系的上下相各5 mL超声溶解，备用。

2.3.3 目标物质分离制备

开启恒温循环器，设定温度为25 ℃，以30 mL/min的流速将上相（固定相）泵入主机管路，待液体流出时，改用5 mL/min的流速泵下相（流动相），同时以800 r/min的转速启动主机。观察到流动相从管柱出口流出，且基线稳定后，将样品溶液从进样口注入。紫外检测器波长为340 nm，记录色谱图，根据色谱图收集并减压干燥目标物质。

2.4 目标物质的鉴定及纯度检测

采用1H-NMR和13C-NMR鉴定得到的目标化合物1和2。经HPLC检测，以分析其纯度。

3 结果与讨论

3.1 提取物的预处理

实验发现，野菊花醇提物直接进样HSCCC进行分离，因组分过于复杂，固定相流失严重，进样量小，达不到理想的分离制备效果。通过不同极性有机溶剂的萃取进行初步分离，尤其可以去掉大部分水溶性物质，使目标物质得到较好的富集。

3.2 溶剂体系的选择

高速逆流色谱中，溶剂体系的选择至关重要，合适的溶剂体系是其分离的关键。通常筛选溶剂体系的方法有HPLC法，TLC法，UV法和分析型HSCCC的应用。该研究采用HPLC测定样品在上下相中的分配系数K值筛选合适的溶剂体系。

实验选取乙酸乙酯-甲醇-水（10∶1∶10；5∶1∶8），乙酸乙酯-正丁醇-水（5∶1∶5；5∶1∶8）体系作为分离的溶剂系统及不同配比，测定K值。当乙酸乙酯-正丁醇-水为5∶1∶5时，K值分别是3.12和5.51，目标化合物分离度较好，且可以和前后杂质分开；固定相保留率为66.7%，分离时间适中，HSCCC分离色谱图见图1。

3.3 HSCCC分离参数的确定

根据试验结果，选择合适的温度，主机转速和流速。结果表明，在20 ℃～30 ℃范围内均获得较理想的效果，故温度定为25 ℃。分离度一般随着转速的增加而增大，但转速增加会引发乳化现象，900 r/min时固定相可见明显流失，因此800 r/min是比较适宜的工作转速。流速越大，固定相保留率越低，分离时间越短，分离度越低，因此，需要在保证分离度的前提下尽可能缩短分离时间，最终采用5 mL/min的流速。综上所述，选定的HSCCC分离条件为：25 ℃，800 r/min，5 mL/min。HSCCC分离图谱见图1。

3.4 产物纯度分析及结构鉴定

按“2.1”节条件对HSCCC所得化合物1和2进行HPLC分析，经面积归一化法计算可知目标物质纯度分别为97.5%和98.4%，如图2所示。

采用1H-NMR和13C-NMR鉴定，经光谱数据与文献对照，鉴定化合物1为蒙花苷，化合物2为木樨草素。

4 结语

该实验通过有机溶剂萃取富集和高速逆流色谱分离纯化，从野菊花粗提物中一步分离制备了蒙花苷和木樨草素。实验结果表明，HSCCC可以分离制备得到高纯度的蒙花苷和木樨草素，分离周期短，操作快捷简便，为从野菊花中分离纯化蒙花苷和木樨草素提供了很好的技术方案。

参考文献

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