鲍鱼脏器β—葡萄糖苷酶提取工艺的优化

罗小娟 杨娟 陈锦权 方婷 陈小艺

摘 要：该研究以鲍鱼脏器为原料，通过冷提取工艺单因素试验，探讨了缓冲液种类、缓冲液pH、料液比、浸提时间对鲍鱼脏器中β-葡萄糖苷酶活力的影响，并通过正交试验确定提取的最佳工艺。在此基础上，采用超声波辅助提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液，确定超声辅助提取的最佳工艺条件。结果表明：料液比、缓冲液pH对提取具有显著性的影响（P<0.05），而浸提时间、缓冲液种类对提取的影响不显著。通过比较超声波辅助提取前后β-葡萄糖苷酶活力的大小，可以看出，超声波处理有利于鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取，最佳提取工艺条件为：缓冲液为0.1mol/L pH3.5乙酸-乙酸钠，料液比1∶4，浸提时间4h，超声时间20min，超声功率200W。

关键词：鲍鱼内脏；β-葡萄糖苷酶；超声波；提取

中图分类号 TQ281 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）18-0016-05

Extraction Technology Optimization of β-glucosidase from Abalone Viscera

Luo Xiaojuan1 et al.

（1College of Food Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China）

Abstract：Abalone viscera was used as raw materials，through single-factor experiments of cold extraction process，the main influence factors on β-glucosidase activity from abalone viscera such as buffer types，pH value of buffer solution，solid-liquid ratio and extraction time had been investigated. The optimum conditions were obtained by orthogonal test. Based on that，the ultrasound-assisted method was applied to extract crude β-glucosidase from abalone viscera and optimize the extractive conditions. The experimental results showed solid-liquid ratio and pH value of buffer solution had a significant effect on the extraction（P<0.05），but extraction time and buffer types had no significant effect on the extraction. By comparing the change of β-glucosidase activity of the samples which were treated by the ultrasonic treatment before and after，we found that ultrasonic treatment was conducive to extraction of the abalone viscera crude β-glucosidase. The optimum technology conditions were determined as follows：buffer was 0.1mol/L pH 3.5 acetic acid-sodium acetate，solid-liquid ratio was 1∶4，extraction time was 4h，ultrasonic time was 20min，ultrasonic power was 200W.

Key words：Abalone viscera；β-glucosidase；Ultrasonic；Extraction

鲍鱼（Abalone）是一种原始的海洋单壳软体贝类，属软体动物门（Mollusca）、腹足纲（Gastropoda）、前鳃亚纲（Prosobranchia）、原始腹足目（Archaeogastropoda）、鲍螺科（Haliotidae）、鲍属[1]。鲍鱼作为名贵的海产品，兼具高营养价值与药用价值[2-3]。鲍鱼脏器约占鲍鱼软组织总重量的1/3，含有丰富的生物活性物质。近年来，相关研究表明鲍鱼脏器多糖含量丰富，具有抗氧化及免疫调节活性[4-5]。同时，已有报道鲍鱼内脏中含有多种酶类，Go'mez-Pinchett等研究表明，鲍鱼内脏中含有纤维素酶、琼脂水解酶和藻酸酶等消化酶[6-7]，宫国君等从鲍鱼内脏中提取出β-1，3-葡聚糖酶粗酶并进行了酶学性质研究[8]，E.Serviere-Zaragoza对鲍鱼内脏中不同组织的消化酶的酶学性质进行了研究[9]。然而，国内外尚未有关于鲍鱼内脏β-葡萄糖苷酶的研究。β-葡萄糖苷酶是一种纤维素酶，能催化水解结合于末端芳基或羟基与糖基原子团之间的非还原性β-D-葡萄糖苷键，生成配基和葡萄糖，可应用于降解纤维素，在生产上具有广泛的应用[10-11]。为提高鲍鱼内脏的利用价值，本研究以皱纹盘鲍内脏为原料，采用常规方法辅以超声波提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液，探讨最佳提取工艺，为该酶的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 （1）材料：皱纹盘鲍内脏：漳州欧圣食品有限公司提供；（2）试剂：对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（p-NPG）购于北京索莱宝科技有限公司；对硝基苯酚，碳酸钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，柠檬酸，柠檬酸三钠，乙酸钠，乙酸，氢氧化钠均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备 JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；TGL-16M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；PH SJ-3F pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；FA1004A电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；HWS-28电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；UV-6300PC紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；QL-866旋涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；冰箱（西门子公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 β-葡萄糖苷酶粗酶液的冷提取 先把冷冻的皱纹鲍鱼内脏解冻，用手术剪去除其尾部的结缔组织，称重，按一定比例（w/v）加入4℃预冷的一定pH缓冲液，用搅拌机间断打浆2min，放置于4℃冰箱中浸提一定时间后，用高速冷冻离心机离心（9 000r/min，4℃，30min），取上清液。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶粗酶液的超声波辅助提取 先把冷冻的皱纹鲍鱼内脏解冻，用手术剪去除其尾部的结缔组织，称重，按一定比例（w/v）加入4℃预冷的一定pH缓冲液，用搅拌机间断打浆2min后，放入超声波细胞粉碎机中，同时采用冰浴冷却，一次超声时间5s，间歇时间10s，处理一段时间后取出，放置于4℃冰箱中浸提一定时间后，用高速冷冻离心机离心（9 000r/min，4℃，30min），取上清液。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶冷提取工艺的单因素试验 以β-葡萄糖苷酶活力为指标，考察缓冲液种类、缓冲液pH、料液比、浸提时间对鲍鱼脏器中β-葡萄糖苷酶冷提取的影响。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶冷提取工艺的正交试验 在单因素实验的基础上，选取影响实验的3个主要因素：缓冲液pH、料液比、浸提时间作为考察因素，在各因素最佳值附近分别取3个水平，采用L9（34）正交试验表进行设计，做3因素3水平正交试验，以确定β-葡萄糖苷酶冷提取的最佳工艺，并进行验证性实验。正交试验设计因素水平见表1。

1.3.5 超声波辅助提取β-葡萄糖苷酶的单因素试验 从超声波处理对鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力影响的角度出发，采用β-葡萄糖苷酶冷提取的单因素试验和正交试验所得的最佳提取条件，分别就影响超声波处理效果的两个主要因素：超声处理时间、超声功率，对所提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力进行考察。

1.3.6 β-葡萄糖苷酶活力测定方法 β-葡萄糖苷酶活力的测定：p-NPG比色法，以400nm处的吸光值来表示β-葡萄糖苷酶活力的大小[]。计算公式如下：

[酶活力（U）=Y×V2×V×NK×V1×T]

式中：Y为酶促反应的吸光度；V1为反应体系中酶液体积（mL）；V2为总反应液体积（mL）；V为酶液的提取体积（mL）；K为对硝基苯酚标准曲线的斜率；T为反应时间（min）；N为稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 对硝基苯酚标准曲线 对硝基苯酚标准曲线如图1，回归方程为y=18.944x+0.0169，R2=0.999 6，斜率K=18.944。

2.2 β-葡萄糖苷酶冷提取工艺的单因素试验

2.2.1 缓冲液种类对酶活的影响 在浸提时间为7h，料液比为1∶2（w/v）的条件下，测定浓度均为0.1mol/L，pH值为3.5的不同种类的缓冲液对β-葡萄糖苷酶活力的影响如图2。由图2可知，缓冲液的种类对鲍鱼脏器粗酶液中β-葡萄糖苷酶活的影响较明显，用0.1mol/L pH6.0乙酸-乙酸钠缓冲液浸提，所提取的上清液中β-葡萄糖苷酶的酶活性最高，故选用乙酸-乙酸钠缓冲液最为合适。

2.2.2 缓冲液pH对酶活的影响 在浸提时间为7h，缓冲溶液为0.1mol/L乙酸-乙酸钠，料液比为1∶2（w/v）的条件下，分别测定不同pH值浸提下粗酶液中β-葡萄糖苷酶活力，见图3。由图3可知，缓冲液的pH对鲍鱼脏器粗酶液中β-葡萄糖苷酶活具有显著的影响。0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液在pH3.0～6.0范围内，随着pH值的增大，所提的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力呈现出先增大后减小的趋势；当0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液pH为3.5时，提取粗酶液的酶活力达到最大值。故应选择pH值为3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液作为鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶的提取液。

2.2.3 料液比对酶活的影响 在浸提时间为7h条件下，选择pH3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液与鲍鱼脏器分别按料液比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5混合，测定粗酶提取液中β-葡萄糖苷酶活力，其结果见图4。由图4可知，所提的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力随着料液比的增加而增大，当料液比为1∶4时酶活力达到最大值；但在料液比达到1∶4后出现明显的下降。故提取的料液比应为1∶4比较适宜。

2.2.4 浸提时间对酶活的影响 在缓冲溶液为pH3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸钠，料液比为1∶4（w/v）的条件下，分别测定浸提时间为1、3、5、7、9h下粗酶提取液中β-葡萄糖苷酶活力大小，其结果见图5。由图5可知，所提的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力随着浸提时间的延长，呈现出先增大后减小的趋势。在浸提时间为5h时，酶活力接近最大值。因此，最佳浸提时间在5h左右比较适宜。

2.3 鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液冷提取工艺的优化 正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

根据极差R值的大小，可得到影响所提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力的因素主次顺序为：料液比>缓冲液pH>浸提时间。

由表2的极差分析和表3的方差分析结果可以看出，在筛选鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液提取工艺条件的过程中，影响所提β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活的因素按关键性依次为B>A>C，即料液比>缓冲液pH>浸提时间。其中，料液比、缓冲液pH对鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取具有显著性的影响（P<0.05），而浸提时间对鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取的影响不显著。

综合分析图6和表3，可以得到提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液最佳工艺条件为：A2 B2 C3，即缓冲液pH3.5，料液比1∶4，浸提时间4h。

2.4 验证试验结果 由表4可知，采用最佳工艺条件提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力可达到140.58 U，与正交试验表中最高基本一致。因此，通过实验验证，正交试验的结果正确。

2.5 超声波辅助提取单因素试验 在上述试验基础上，考察在超声辅助提取过程中，超声处理时间、超声功率对粗酶液的酶活力的影响。

2.5.1 超声处理时间对酶活的影响 在固定超声功率为200W时，考察不同超声处理时间对所提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力的影响，结果如图7所示。由图7可知，当处理时间小于20min时，所提的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力随时间的增加而增大；当处理时间大于20min时，粗酶液的酶活力随时间的增大而下降。此结果出现的原因可能是由于超声处理时间短（小于20min），不足以破碎细胞，释放细胞内的β-葡萄糖苷酶；而长时间的超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，导致局部过热，β-葡萄糖苷酶的高级结构遭到破坏，使部分酶变性失活。故选定超声处理时间为20min时，酶活力最高。

2.5.2 超声功率对酶活的影响 在固定超声时间为20min时，考察不同超声功率对所提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力的影响，结果如图8所示。由图8可知，超声波的输出功率对细胞破碎效果具有显著的影响。当超声功率小于200W时，随超声功率的增加，所提的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力逐渐增大；当超声功率在200～600W范围内，粗酶液的酶活力随功率的增大而下降。该结果产生的原因可能是由于超声功率较小（小于200W），超声功率的增大，有利于液体中空穴的形成，产生更多的空化泡，使细胞破碎作用增强；而超声功率过大导致局部过热，使部分酶变性失活。故超声功率采用200W较为适宜。

2.6 两种提取方法的比较 冷提取的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力为140.58U，超声波辅助提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力为174.71U，酶活力提高34.13U。由此可见，超声波处理得到的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力更高，超声波辅助方法更有利于鲍鱼脏器中β-葡萄糖苷酶的提取。

3 结论

用新鲜的皱纹盘鲍脏器为原料，通过冷提取工艺的单因素试验和正交试验、超声波辅助提取工艺的单因素试验，最后确定了一整套冷提取方法辅以超声波提取鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的工艺。冷提取方法各因素对酶活影响：料液比、缓冲液pH对提取具有显著性的影响（P<0.05），而浸提时间、缓冲液种类对提取的影响不显著。通过比较冷提取与超声波辅助提取方法，可以看出，超声波处理有利于鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取，其最佳提取工艺条件为：缓冲液为pH3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸钠，料液比1∶4，浸提时间4h，超声时间20min，超声功率200W。研究结果为鲍鱼脏器酶的开发利用提供了一定的试验依据。

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