受体胚龄对鸡原始生殖细胞移植后归巢的影响

陈美娟 陈东阳 谢龙 陆振萍 杨蒙蒙 莫丽芬 卢克焕 陆阳清

摘要：【目的】探究受体胚龄对鸡原始生殖细胞（Primordial germ cell，PGC）移植后归巢的影响，确定最佳回注时间窗口，为提高转基因鸡的生产效率提供参考依据。【方法】从广西黄羽鸡胚分离获得PGC，体外培养并进行转基因操作后，移植回注到不同胚龄的受体鸡胚中，移植5 d后分离性腺拍照观察，对比受体鸡胚孵育至14HH～17HH时对PGC迁移归巢到性腺的影响。【结果】分别在14HH～17HH胚龄时移植回注PGC，移植5 d后的鸡胚死亡率为30.0%～

60.9%，但不同移植胚龄间的差异不显著（P>0.05）。根据鸡胚性腺中的GFP阳性细胞数可划分为6个等级（I～VI），且随着移植胚龄的增加，PGC迁移效率呈下降趋势。14HH胚龄移植的鸡胚性腺GFP阳性细胞集中在V级（40.0%），15HH胚龄移植的集中在III级（42.1%），16HH和17HH胚龄移植的则集中在II级（45.4%和54.5%），GFP阳性细胞含量最高等级（VI级）仅出现在14HH胚龄移植的鸡胚性腺中。【结论】随着受体胚龄的增加，PGC迁移效率呈下降趋势，但鉴于实际操作的难易程度，确定PGC移植回注的最佳时间窗口为14HH鸡胚（孵育50 h）。

关键词： 鸡；原始生殖细胞；移植胚龄；迁移效率；转基因

中图分类号： S831 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）06-1014-05

0 引言

【研究意义】禽类在畜牧业生产中占据重要地位，且作为模型动物已广泛应用于发育生物学及医学研究。相对于其他哺乳动物，禽类具有独特的优势，如繁殖周期短、个体小、饲养成本低、胚胎易于操作等（徐国正等，2007；李俊营等，2014；吴双等，2014）。由于禽类胚胎发育模式的特殊性，其受精卵从体内产下时已是一个含有几万个细胞的早期胚胎，导致禽类受精卵转基因技术受到限制。原始生殖细胞（Primordial germ cell，PGC）作为配子的前体细胞，能将遗传信息传递给下一代，若能分离培养PGC并进行基因操作，移植生成的精子或卵子將可用于生产转基因动物。【前人研究进展】近年来，许多有关PGC起源及迁移的研究证实禽类PGC具有独特的迁移方式。Nakamura等（2007）研究发现，鸡PGC起源于上胚层，孵育至10HH时集中于头部，11HH开始进入血脉系统，14HH时在血液中达到峰值，然后向生殖脊迁移，至17HH时归巢生殖脊处。李碧春等（2010）研究证实，鸡PGC在发育过程中以血液系统为载体从生殖新月区迁移到性腺。禽类PGC的迁移规律为分离PGC体外培养并进行基因操作提供了依据，同时使得利用PGC生产转基因禽类具有可行性。根据PGC在鸡胚体内的迁移及分布情况，Shiue等（2009）从孵育5.5 d的鸡胚性腺中分离获得性腺PGC，并在体外进行长期培养；Tonus等（2014）从孵育至13HH～18HH的鸡胚血液中成功分离获得PGC。PGC经过体外培养及基因修饰后，仍保持其生物学特性，回注到鸡胚血脉系统后可迁移到性腺并发育成功能性配子，产生转基因后代（van de Lavoir et al.，2006）。【本研究切入点】在利用PGC为载体进行家禽基因操作过程中，由于PGC迁移仅发生在特定的时间窗口，因而受体胚龄将影响PGC迁移及生殖系嵌合体鸡的制备效率，但至今鲜见有关受体胚龄对鸡PGC移植归巢影响的研究报道。【拟解决的关键问题】探析广西黄羽鸡胚孵育至14HH～17HH时回注PGC细胞的效果，确定最佳的PGC回注时间窗口，为提高转基因鸡的生产效率提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验种蛋来源及孵育

种蛋为广西黄羽鸡蛋，由广西富凤农贸有限公司提供。鸡胚孵育温度37.8 ℃，相对湿度60%，孵育期按Hamburger和Hamiltion（1992）标准进行划分。

1. 2 细胞来源及培养

从孵育至14HH～15HH的黄羽鸡胚血液中分离获得PGC。PGC接种至经γ射线处理的MEF饲养层上，用CKO培养液进行培养，培养箱参数37 ℃、5% CO2。CKO培养液中含66% KO-DMEM、20% BRL培养液、7.5%特级胎牛血清（FBS）、2.5% Chicken Serum、1×GS Nucleoside Supplement、1×GlutaMAXTM、1×Anti-anti、0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol、4 ng/mL Human recombinant FGF。培养细胞每2 d半量换液1次，每4～5 d传代1次。

1. 3 转染绿色荧光蛋白（GFP）基因及筛选

PiggyBac转座子内含GFP基因及嘌呤霉素筛选基因。转染前将PGC转移到24孔板中，然后按照Lipofectamine■ LTX & PLUSTM Reagent转染试剂盒说明进行转染，转染6 h后收集细胞，离心，重悬后接种到新的饲养层上，加入新鲜CKO培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞长满后加入1 μg/mL嘌呤霉素进行筛选，连续筛选3代即获得稳定表达GFP基因的细胞系。

1. 4 鸡胚胚期确定

鸡胚分别孵育50、55、60和65 h，沿气室将气室钝端蛋壳揭去，掀去内壳膜，暴露出鸡胚。然后用注射器将台盼蓝注射到胚盘下方，体视显微镜下观察鸡胚的体节，每个时间组观察3枚鸡胚。

1. 5 PGC移植

鸡胚分成4组，分别孵育50、55、60和65 h后进行移植注射。具体操作步骤：收集GFP-PGC离心，重悬，细胞计数，取所需细胞数，加培养液至总体积的90%，然后加入10%台盼蓝，混匀。将孵育到预定时间的鸡胚取出，酒精喷洒表面并擦干，照蛋确定气室，在气室中间用弯头镊子开一个直径约0.5 cm的小孔，用尖镊撕开蛋壳膜，暴露出鸡胚。用微量注射针吸取细胞，注入鸡胚血脉系统中，每枚鸡胚注入1万个细胞。用封口膜封闭，将鸡胚放回孵育箱中继续孵育。

1. 6 解剖鸡胚分离性腺

移植注射5 d后取出活胚，用镊子分离鸡胚性腺，置于滴有80 μL PBS的载玻片上，盖上盖玻片，倒置荧光显微镜下观察并拍照，统计GFP阳性细胞数或判定性腺中迁移细胞的等级。由于性腺中的GFP阳性细胞数超过500个时，细胞重叠造成计数困难，因此将性腺按照如下规则划分为6个等级。Ⅵ级：两条性腺布满GFP阳性细胞；Ⅴ级：一条性腺全满，另一条性腺半满或两条都是一大半；Ⅳ级：一条性腺全满，另一条性腺很少或两条性腺都是半满；Ⅲ级：一条性腺半满，另一条性腺很少或两条性腺加起来超过500个GFP阳性细胞；Ⅱ级：GFP阳性细胞数在200～500个；Ⅰ级：GFP阳性细胞数少于200个。

1. 7 数据处理

以ImageJ 1.45统计细胞数，采用GraphPad Prism v5.0对试验数据进行处理。

2 结果与分析

2. 1 PGC培养及转染GFP基因

在经γ射线处理的MEF饲养层上，PGC生长状况良好，细胞呈圆形、边缘光亮、体积较大、细胞核大等形态特征。PGC增殖较快，通常能看到两个连在一起或成串的细胞。用Lipofectamine■ LTX & PLUSTM Reagent转染PiggyBac转座子，结果获得表达绿色荧光蛋白的PGC（称为GFP-PGC）（图1），共转染两孔，转染效率分别为5.03%和6.16%。经过3代筛选后，获得表达GFP的细胞株。

2. 2 鸡胚胚龄的确定

于鸡胚孵育到相应的时间后打开鸡胚，在鸡胚胚盘下注射台盼蓝，通过观察鸡胚的体节（图2）而确定广西黄羽鸡胚孵育时间所对应的胚龄。结果表明，孵育50、55、60、65 h的鸡胚分别出现21～22对、24～25对、27～28对和30～32对体节，对应的胚龄为14HH、15HH、16HH和17HH。

2. 3 移植胚龄对鸡胚存活率的影响

分别在孵育至14HH、15HH、16HH和17HH时移植PGC，移植5 d后将鸡蛋打开，观察鸡胚的死亡情况。结果如图3所示，鸡胚死亡率为30.0%～60.9%，方差分析结果显示4个移植胚龄间的鸡胚死亡率差异不显著（P>0.05）。

2. 4 PGC的迁移效率

荧光显微镜下观察不同受体胚龄移植GFP-PGC的迁移效率，每组检测20枚鸡胚，共检测80枚。结果表明，根据鸡胚性腺中GFP阳性细胞数可划分为6个等级（I～VI），且随着孵育时间的增加，PGC迁移效率呈下降趋势（图4）。14HH移植组鸡胚性腺中的GFP阳性细胞集中在V级（40.0%），15HH移植组的集中在III级（42.1%），16HH和17HH移植组则集中在II级（45.4%和54.5%），GFP阳性细胞含量最高等级（VI级）仅出现在14HH移植组（图5），说明鸡胚孵育至14HH时回注PGC的迁移效率最高。

3 讨论

转基因家禽作为发育生物学研究的一个理想生物体模型（Rashidi and Sottile，2009），可用于培育抗病或高生产性能的优良品种家禽及药用蛋白的生物反应器（Lillico et al.，2005），具有广泛的应用前景。McGrew等（2004）将重组慢病毒注射到新鲜产下的受精蛋胚盘中，获得转基因嵌合体后代。Macdonald等（2012）利用PiggyBac及Tol2转座子有效转染PGC后回注到鸡胚血脉系统，获得表达GFP蛋白的转基因鸡。Tyack等（2013）用miniTol2转座子质粒直接体内转染PGC获得稳定的生殖系转基因公鸡，且能将转基因传递给下一代。但这些研究获得转基因鸡的效率均相对较低，因此有必要进一步提高外源PGC迁移到性腺的效率而提高转基因嵌合效率。本研究通过系统探究移植时间对PGC迁移效率的影响，结果发现鸡胚孵育至50 h（14HH）时移植PGC的迁移效率较孵育至更后期再移植的高，与Nakamura等（2007）研究表明鸡PGC于14HH时在血液中达到峰值相符。

根据PGC在鸡胚发育不同时期的迁移和分布情况，有关学者已成功从血液、性腺中分离获得鸡PGC （Shiue et al.，2009；Tonus et al.，2014）；但由于PGC在體外易分化，为保持其未分化状态及生物学特性，通常需要在培养液中添加FGF、LIF、SCF等各种生长因子。本研究以孵育14HH～15HH鸡胚血液为分离材料，用MEF饲养层及KO-DMEM培养液进行培养，成功分离获得雄性PGC细胞系，为后续转基因研究提供了充足的细胞来源。本研究选用的鸡胚孵育50 h为21～22对体节、55 h为24～25对体节、60 h为27～28对体节、65 h为30～32对体节，分别对应14HH、15HH、16HH和17HH，与Hamburger和Hamiltion（1992）、李碧春等（2000）研究观察到的鸡胚发育时期一致。此外，本研究分别统计14HH～17HH鸡胚移植PGC后的死亡率，结果表明，移植5 d后鸡胚的死亡率为30.0%～60.9%，越早期进行注射移植，鸡胚死亡率越高，但差异不显著。鸡胚在整个孵育阶段有两个死亡高峰，一个是在孵育3～5 d，另一个是在18 d以后（薛松磊等，2013）。本研究在鸡胚龄14HH～17HH（孵育50～65 h）时进行显微注射，可能也是造成鸡胚死亡增加的一个重要原因。但由于更早期的鸡胚血液系统尚未完全发育，注射操作十分困难，因此PGC移植注射的最佳时间窗口为14HH鸡胚。

4 结论

随着受体胚龄的增加，PGC迁移效率呈下降趋势，但鉴于实际操作的难易程度，确定PGC移植注射的最佳时间窗口为14HH鸡胚（孵育50 h）。

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（責任编辑 兰宗宝）