超声处理抑制鲜切马铃薯酶促褐变的机理研究

杨明冠，朱传合

（山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安　271018）



超声处理抑制鲜切马铃薯酶促褐变的机理研究

杨明冠，*朱传合

（山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018）

摘要：以鲜切马铃薯为试材，通过研究不同超声处理条件对酶促褐变底物、产物以及多酚氧化酶的影响，揭示了超声处理抑制鲜切马铃薯酶促褐变的机理。结果表明，超声处理对酶促褐变底物、产物并没有影响，且能够显著抑制多酚氧化酶的酶活力。以超声功率600 W超声处理90 min，马铃薯多酚氧化酶的酶活力仅为原酶液的54.21%，可见超声处理抑制鲜切马铃薯酶促褐变是通过抑制相关酶的活力来实现。

关键词：鲜切马铃薯；酶促褐变；超声处理；多酚氧化酶

0　引言

鲜切马铃薯是指新鲜马铃薯经清洗、修整、去皮、切割并包装成供消费者立即使用的产品[1]。鲜切马铃薯作为一种新型的马铃薯初加工制品备受消费者青睐，在众多的微加工果蔬中马铃薯的消费量逐渐增大。然而，鲜切果蔬由于切割伤害使得原本区域化分布的酚类物质和酚酶接触，从而酚类物质被氧化生成邻苯二醌，继而转化为褐色素，导致褐变[2]。酶促褐变是鲜切果蔬最主要的品质问题，导致鲜切产品感官品质下降、营养损失及货架期缩短，大大限制了鲜切果蔬业的发展。酶促褐变反应的发生，需要同时具备酚类底物、酚酶和氧气3个条件。因此，可以通过减少酚类物质含量、抑制酶促褐变相关酶的活性以及降低氧气浓度来控制鲜切马铃薯的酶促褐变。例如，抗坏血酸可以通过减少褐变底物抑制酶促褐变[3-4]；热处理、亚硫酸盐、静高压以及高密度二氧化碳可以通过抑制酶活性来抑制酶促褐变[5-8]；涂膜则可以通过隔绝氧气抑制酶促褐变[9]。

超声处理作为一种非热加工手段已经在食品行业有着广泛的应用。超声波是物质介质中的一种弹性机械波，利用其振动能量，可以在介质中产生强大的剪切力和高温，来改变物质的组织结构、状态及功能[10]。前期研究已经报道证实了超声处理可以抑制鲜切马铃薯的酶促褐变[11]，但是对超声处理抑制鲜切果蔬酶促褐变的机理目前尚不清楚。

本试验以鲜切马铃薯为试验材料，旨在探究超声处理抑制鲜切马铃薯酶促褐变的机理，为了更加系统地阐明超声抑制鲜切马铃薯酶促褐变的机理，采用模拟体系探究了超声处理对鲜切马铃薯酶促褐变底物、产物以及酶促褐变相关酶的影响，从而揭示超声处理抑制鲜切马铃薯酶促褐变的机理，为控制鲜切果蔬酶促褐变提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

马铃薯（荷兰15号），购于泰安市农贸市场，贮藏于4℃的冷库中备用。马铃薯PPO酶粉，购于Sigma公司，L -多巴、L -酪氨酸，均为分析纯。

JA2002型电子天平，上海精天电子仪器有限公司产品；KQ- 600DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；TGL- 18C- C型高速台式冷冻离心机，上海安亭公司产品；DZKW- C型数显恒温水浴锅，黄骅市卸甲综合电器厂产品；UV-2102PC型紫外可见分光光度计，上海尤尼柯有限公司产品；Vertex- 70型红外光谱仪，德国BRUKER公司产品。

1.2分析方法

1.2.1褐变底物结构分析方法

（1）紫外吸收光谱分析法。波长范围为200～800 nm，光谱带宽为2 nm。

（2）红外光谱分析法。采用KBr压片法，波数扫描范围4 000～400 cm-1，分辨率2 cm-1。

（3）液质联用分析法。①色谱分析条件：色谱柱为C18柱（3.5 μm，250 mm×4.6 mm），柱温30℃，进样量10 μL，流速1 mL/min，流动相为甲醇-水-冰醋酸。②质谱分析条件：电喷雾离子化源，正离子模式，扫描范围10～200 m/z，毛细管电压1.5 kV，雾化气压力30 psi，干燥气温度300℃。

1.2.2褐变产物量分析方法

由于酶促褐变产物于波长475 nm处有最大吸收峰[12]，故采用△A475表示褐变产物的量。

1.2.3PPO酶活测定方法

采用紫外分光光度法测定PPO酶活。反应体系中依次加入1.8 mL pH值6.6的磷酸缓冲液，1.0 mL 0.5 mmo1/L的L -多巴溶液以及0.2 mL PPO酶液，所加试剂均在30℃温育15 min，于波长475 nm处进行比色。加酶液后立刻开始计时，每30 s记录A475值，连续记录3 min，对照不加酶液，重复测定3次。酶活以1 mL酶液1 min OD值每增加0.001为1个活力单位。

1.3试验方法

1.3.1超声处理对酶促褐变底物的影响

超声处理L -酪氨酸、L -多巴溶液30 min，以不做处理为对照，采用紫外吸收光谱、红外光谱、质谱对其分析。

模拟酶促褐变体系，在酶的最适反应条件下以超声功率600 W超声处理30 min的L -多巴溶液为反应底物，以不做超声处理的底物溶液为对照，分别加入反应体系测定酶促褐变反应，以△A475表示褐变产物的量。

1.3.2超声处理对酶促褐变产物的影响

模拟酶促褐变体系，使底物完全反应后加热灭酶，超声处理并作对照，以体系中最终酶促褐变产物的量来判断超声处理是否对酶促褐变产物有影响。设置2个试验组，在最适反应条件下加入反应液，加酶液后立刻计时，每1 min记录A475值，15 min后加热灭酶，处理组超声功率600 W超声处理30 min，对照组在相同温度下水浴30 min，记录A475值至20 min，以△A475表示褐变产物的量。

1.3.3超声处理对酶促褐变反应体系的影响

设置3个试验组，在最适反应条件下加入反应液，加酶液后立刻计时并记录A475值。对照组1反应15 min，对照组2和处理组反应3 min后加热灭酶，处理组超声功率600 W超声处理30 min，对照组2在相同温度下水浴30 min，然后加入等量的酶液记录A475值至15 min，以△A475表示褐变产物的量。

1.3.4超声处理对鲜切马铃薯PPO酶活力的影响

固定超声频率为40 kHz，以鲜切马铃薯PPO酶为研究对象，分别研究超声功率、超声时间、超声温度、pH值对PPO酶活力的影响。

1.3.5数据分析

各项试验均重复3次，采用DPS 7.05软件进行方差分析，显著性水平p＜0.05。

2　结果与分析

2.1超声处理对酶促褐变底物的影响

2.1.1超声处理对底物紫外吸收光谱的影响

30℃条件下，采用超声频率40 kHz，不同功率超声处理L -多巴、L -酪氨酸溶液30 min，以不做超声处理为对照，分别测定其紫外吸收光谱。

超声处理对酶促褐变底物紫外吸收光谱的影响见图1。

图1中（a）、（b）分别是超声处理对L -酪氨酸、L -多巴紫外吸收光谱的影响。由图1（a）可知，L -酪氨酸于270～280 nm处有一个明显的吸收波峰，275 nm处有最大吸收值。由图1（b）可知，L -多巴于275～285 nm处有一个明显的吸收波峰，280 nm处有最大吸收值。超声处理并没有改变L -酪氨酸和L -多巴的紫外吸收光谱，处理后的紫外吸收光谱与未经超声处理基本一致。根据图1显示，超声处理对底物紫外吸收光谱基本没有影响，故后续试验处理选用超声功率为600 W。

2.1.2超声处理对底物红外光谱的影响

30℃条件下，采用超声频率40 kHz，超声功率600 W的超声处理L -多巴、L -酪氨酸溶液30 min，以不做超声处理为对照，分别测定其红外光谱。

图1　超声处理对酶促褐变底物紫外吸收光谱的影响

超声处理对酶促褐变底物红外光谱的影响见图2。

图2　超声处理对酶促褐变底物红外光谱的影响

由图2（a）可知，超声处理对L -酪氨酸酚羟基吸收峰（3 205 cm-1）、氨基吸收峰（3 135 cm-1）、苯环上C- H键伸缩振动吸收峰（3 000～3 100 cm-1）、羰基吸收峰（1 588 cm-1）、苯环对二取代C- H弯曲振动吸收峰（798 cm-1）、苯环C- H弯曲振动吸收峰（649 cm-1）没有影响。图2（b）可知，超声处理对L -多巴酚羟基吸收峰（3 401 cm-1）、氨基吸收峰（3 210 cm-1）、苯环上C- H键伸缩振动吸收峰（3 000～3 100 cm-1）、羰基吸收峰（1 655 cm-1）、苯环1,2,4 -三取代C- H弯曲振动吸收峰（816 cm-1）、苯环C- H弯曲振动吸收峰（676 cm-1）也没有影响。可见，超声处理对L -酪氨酸、L -多巴的峰形和出峰位置均没有影响，只是在吸收强度上略有差异。

2.1.3超声处理对底物质谱的影响

30℃条件下，采用超声频率40 kHz，超声功率600 W的超声处理L -多巴、L -酪氨酸溶液30 min，以不做超声处理为对照，分别测定其质谱。

超声处理对酶促褐变质谱的影响见图3。

图3　超声处理对酶促褐变质谱的影响

图3中（a）、（b）分别是超声处理对L -酪氨酸、L -多巴质谱的影响。由图3（a）可知，L -酪氨酸处理组与对照组的质谱图基本重合，181 m/z分子离子峰以及主要的峰都没有差异。图3（b）中显示，经过超声处理的L -多巴溶液质谱图与对照组也基本重合，197 m/z分子离子峰以及主要的峰都没有差异。

2.1.4超声处理底物对酶促褐变反应的影响

30℃条件下，将超声处理底物（600 W，30 min）及未经超声处理底物加入酶促褐变反应体系，以A475值为指标表示褐变反应的程度，研究超声处理底物对酶促褐变反应的影响。

超声处理底物对酶促褐变反应的影响见图4。

由图4可知，处理组与对照组15 min后基本反应完全，反应时间内△A475没有差异性（p＞0.05），可见超声处理与未经超声处理的底物对酶促褐变反应没有影响。结合处理前后底物的紫外吸收光谱、红外光谱、质谱推知，超声处理底物对酶促褐变反应没有影响。

2.2超声处理对酶促褐变产物的影响

图4　超声处理底物对酶促褐变反应的影响

酶促褐变体系反应15 min后加热灭酶，作为酶促褐变产物。30℃条件下，超声处理（600 W，30 min）产物，以未经超声处理产物为对照，以A475值为指标，研究超声处理对酶促褐变产物的影响。

超声处理对酶促褐变产物的影响见图5。

图5　超声处理对酶促褐变产物的影响

由图5可知，处理组与对照组15 min后基本反应完全，反应时间内酶活曲线基本一致，△A475没有差异性（p＞0.05），反应15 min后加热灭酶，A475值有轻微的上升并保持不变。试验过程中处理组与对照组△A475并没有差异性，可见超声处理对酶促褐变产物没有影响。

2.3超声处理对酶促褐变反应体系的影响

酶促褐变体系反应3 min后加热灭酶，以此反应液作为反应中间体系。30℃条件下，将超声处理的中间体系（600 W，30 min）及未经超声处理的中间体系加酶液继续反应，以A475值为指标表示褐变反应的程度，以不做任何处理的反应体系为对照1，未经超声处理的中间体系为对照2，研究超声处理对反应体系的影响。

超声处理对酶促褐变反应体系的影响见图6。

由图6可知，对照组1反应时间内与酶促反应进程曲线非常吻合，处理组和对照组2在3.5 min时出现了较大的增幅，这是由于体系中新加酶液使得酶促反应又得以快速进行，3.5 min后反应比较符合酶促反应进程曲线。由图6可以看出，处理组和对照组2的反应曲线相差不大，△A475并没有差异性。推知，超声处理对酶促褐变反应体系没有影响。

2.4超声处理对PPO的影响

图6　超声处理对酶促褐变反应体系的影响

2.4.1超声功率对PPO的影响

30℃，pH值6.6条件下，超声频率40 kHz以不同超声功率（240，300，360，420，480，540，600 W）超声处理60 min，以不做超声处理为对照，研究超声功率对PPO酶活力的影响。

超声功率对PPO酶活力的影响见图7。

图7　超声功率对PPO酶活力的影响

由图7可知，试验过程中对照组PPO酶活力很稳定并基本维持不变，以对照组酶活力为100%探究超声功率对鲜切马铃薯PPO酶活力的影响。由图7可知，超声处理可以显著抑制PPO酶活力，并且随着超声功率的增大，酶活力迅速降低。在240 W处理条件下PPO酶活力为对照组酶液的93.01%，而以超声功率600 W超声处理后PPO酶活力仅为原酶液的66.43%。这与文献报道的随着超声功率增加POD酶、ATP酶活力下降的结论一致[13]。酶活力的高低从根本上取决于酶分子构象的合理程度，高强度超声处理酶溶液时会产生瞬态空化作用，瞬间产生高温、高压、高能量密度冲击波、微射流等极端物理作用，而酶分子在强大的剪切力和冲击波的作用下，分子结构被破坏，甚至被剪切成小碎片而表现出酶活力下降甚至失活[14]。

2.4.2超声时间对PPO的影响

30℃，pH值6.6条件下，超声频率40 kHz、超声功率600 W处理不同超声时间（15，30，45，60，75，90 min），以不做超声处理为对照，研究超声时间对PPO酶活力的影响。

超声时间对PPO酶活力的影响见图8。

由图8可知，试验过程中对照组的PPO酶活力基本维持不变，随着超声时间的延长，马铃薯PPO酶活力呈现出下降的趋势。600 W超声处理15 min 后PPO酶活力下降幅度较小，酶活力为原酶液的89.70%；而经过超声处理90 min后PPO酶活力显著下降，仅为原酶液的54.21%。在一定时间范围内超声处理PPO，随着超声时间的延长PPO酶活力降幅较大，此后继续延长超声时间PPO酶活力的降幅变小，这说明超声处理一定时间后，继续延长超声时间对PPO酶活力的影响较小。这可能是由于高强度超声场致效应改变了PPO的分子构象，从而导致了酶活力在短时间内迅速降低；由于酶结构具有柔性，继续延长超声时间，对PPO结构也不会再有更进一步的影响。

图8　超声时间对PPO酶活力的影响

2.4.3超声温度对PPO的影响

pH值6.6条件下，超声频率40 kHz，超声功率600 W在不同超声温度（20，25，30，35，40，45，50℃）条件下处理15 min，以不做超声处理为对照，研究超声温度对PPO酶活力的影响。

超声温度对PPO酶活力的影响见图9。

图9　超声温度对PPO酶活力的影响

由图9可知，马铃薯PPO最适宜温度是30℃，超声温度过低会抑制PPO酶活力，而超声温度过高会破坏PPO的分子构象，从而使酶失活。超声温度对超声处理后PPO酶活力的影响趋势和未经超声处理的趋势相近，并没有改变PPO的温度条件，最适温度仍为30℃。经过超声处理后PPO的酶活力都较对照组有所下降，在30℃条件下比较明显，酶活力为原酶液的89.17%。

2.4.4超声处理下不同pH值对PPO的影响

30℃条件下，超声频率40 kHz，超声功率600 W在不同pH值（5.4，5.8，6.2，6.6，7.0，7.4，7.8，8.2）条件下处理15 min，以不做超声处理为对照，研究pH值对PPO酶活力的影响。

pH值对PPO酶活力的影响见图10。

图10　pH值对PPO酶活力的影响

由图10可知，马铃薯PPO最适宜pH值范围为6.2～7.0。经过超声处理后马铃薯PPO的最适pH值也是在这一个范围内，表明超声处理并没有改变PPO的稳定pH值条件。试验中不同pH值条件下超声处理后PPO的酶活力都较空白有所降低，pH值为6.2，6.6，7.0的条件下，酶活力分别为原酶液的84.37%，88.33%，86.04%。

3　结论

（1）超声处理对酶促褐变底物、产物没有影响。

（2）超声处理并没有改变PPO的最适温度、pH值条件，却可以显著抑制PPO的酶活力。随着超声功率的增大、超声时间的延长，PPO的酶活力逐渐降低。

（3）超声处理抑制酶促褐变通过抑制相关酶的活力来实现。

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Study on Mechanism of Ultrasound Inhibiting Enzymatic Browning of Fresh- cut Potato

YANG Mingguan，*ZHU Chuanhe
（College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai'an，Shandong 271018，China）

Abstract：The effects of different ultrasonic treatment conditions on enzymatic browning substrates and products and polyphenol oxidase（PPO）activity of fresh- cut potato are investigated. The results indicat that ultrasonic treatment has no effects on enzymatic browning substrates and products，while potato PPO activity is significantly inhibition treated by different ultrasonic treatment conditions. PPO activity decrease to 54.21% of the original treated by ultrasound at power of 600 W for 90 min. It indicates that the inhibition of ultrasound on enzymatic browning of fresh- cut potato is realized by inhibiting the enzyme activity of related enzymes.

Key words：fresh- cut potato；enzymatic browning；ultrasonic treatment；PPO

*通讯作者：朱传合（1978—），男，博士，副教授，研究方向为果蔬加工。

作者简介：杨明冠（1992—），男，硕士，研究方向为果蔬加工。

基金项目：山东省自然科学基金项目（ZR2012CM038）；国家“十二五”科技支撑项目（2012BAK17B05）。

收稿日期：2016- 02- 14

文章编号：1671- 9646（2016）03b- 0001- 05

中图分类号：TS255.3

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.027