丹参酮Ⅱ-A对大鼠成骨细胞体外增殖分化的影响*

莫朝伦， 张军梅*， 贾　莹， 王薮馨， 吴　忧， 刘　秒， 张凤丹

(贵州医科大学附院 口腔科， 贵州 贵阳　550004)



丹参酮Ⅱ-A对大鼠成骨细胞体外增殖分化的影响*

莫朝伦**， 张军梅***， 贾莹， 王薮馨， 吴忧， 刘秒， 张凤丹

(贵州医科大学附院 口腔科， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 研究丹参酮Ⅱ-A(TsII-A)对大鼠成骨细胞(OB)体外增殖分化的影响。方法： 分离、培养、纯化SD乳鼠颅盖骨OB，选择传代至第3代的OB进行细胞形态学鉴定；将第3代OB分为实验组及对照组，实验组给予5×10-3mg/L、5×10-2mg/L及5×10-1mg/L TsII-A处理，对照组OB加入与实验组等量的完全培养基DMEM；于接种后第1、3、5、7天4个时间点观察TsII-A对OB增殖的影响；于接种后第5天检测OB中碱性磷酸酶(ALP)活性。结果： 分离、培养所得的细胞符合OB的形态学特征；与对照组比较，实验组不同浓度TsII-A对OB均有促增殖的作用(P<0.05)，其中5×10-2mg/L浓度组促增殖作用最大；培养OB至第5天时实验组中ALP活性高于对照组(P<0.05)。结论: TsII-A在一定的作用时间内，对体外培养的OB具有促增殖分化作用。

[关键词]丹参酮Ⅱ-A； 成骨细胞； 碱性磷酸酶； 增殖分化； 正畸学； 牙移动

适宜的正畸矫治力通过牙作用于牙周组织后，诱导压力侧牙槽骨破细胞(osteoclast，OC)的形成和骨吸收，促进张力侧成骨细胞(osteoblast，OB)新生和新骨沉积，形成骨塑建，最终导致正畸牙移动。OB是骨塑建的物质基础,它来源于具有多向分化潜能的间充质干细胞，可分泌一系列骨蛋白，包括碱性磷酸酶(akaline phosphatase，ALP)和多种细胞外基质蛋白，如骨钙素、骨桥蛋白、骨延蛋白和Ⅰ型胶原等，并通过分泌一些细胞因子参与骨形成过程，同时控制骨基质的矿化过程，说明OB是骨组织更新活动中最重要的功能细胞和效应细胞[1]。ALP是OB成熟的重要标志酶之一 ，定量检测ALP的活性可以客观地反映OB的分化水平。丹参属活血化淤类传统中药，具有改善OB的功能，促进骨折愈合[2]；丹参亦可促进正畸牙移动中牙槽骨的塑建和调整，加速正畸牙移动[3-5]。丹参酮Ⅱ-A(tanshinone Ⅱ-A，TsⅡ-A)属于丹参的有效活性成分，具有心血管药理作用、雌激素样活性、抗菌消炎和促骨代谢等药理作用[6]。本实验应用TsⅡ-A作用于体外培养的大鼠乳鼠OB，探讨TsⅡ-A对OB增殖分化的作用及其对正畸牙移动中骨塑建的影响。

1材料和方法

1.1材料

TsII-A购于Aladdin-阿拉丁试剂(上海)有限公司。新生SD大鼠乳鼠，体质量7～8 g，由贵州医科大学实验动物中心[SCXK(黔)2012-0001]提供。DMEM高糖培养基(Hyclone， 美国)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，青/链霉素双抗(北京索宝莱生物科技有限公司)，0.1%Ⅰ型胶原酶(Gibco，美国)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美国)，Cell counting Kit8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒(日本同仁)，ALP试剂盒(南京建成生物工程研究所)，茜素红指示剂(北京索宝莱生物科技有限公司)。超净工作台(苏净集团安泰公司)，CO2细胞培养箱(MCO-18AIC型，Sanyo，日本)，离心机(HC-2062)，倒置相差显微镜(XD-101型，江南公司)及全自动酶标仪(Bio-rad-680)。

1.2方法

1.2.1OB分离培养 、传代纯化及鉴定将新生的SD大鼠颅盖骨剪成碎骨片，通过酶消化法提取原代OB，并利用差速贴壁法纯化OB至第3代[7]。通过形态学观察、ALP染色(钙钴法)和茜素红染色对获得的OB进行鉴定。

1.2.2TsⅡ-A浓度筛选采用CCK-8试剂比色筛选最适宜的TsⅡ-A浓度，第3代OB以2×107个/L密度的细胞悬液接种于96孔板(1×10-4L/孔)。实验组设置为5×10-3mg/L、5×10-2mg/L及5×10-1mg/L 3个浓度，对照组仅加入与实验组等量的完全培养基DMEM，各组均设4个复孔；于接种后第1、3、5、7天4个时间点观察。

1.2.3成骨细胞数量在各时间点，各组待测细胞均用CCK-8溶液(1×10-5L/孔)孵育2 h后，于酶标仪450 nm处读取OD值。

1.2.4ALP活性第3代OB以5×105个/孔的密度接种于6孔板，依据CCK-8试剂盒比色试验筛选出最适宜的TsⅡ-A浓度作为实验组，对照组仅加入等量完全培养基DMEM,各组设5个复孔。各组培养至第5天，吸取培养液，1 500 r/min离心10 min取上清液，用ALP试剂检测ALP活性，于酶标仪520 nm处读取OD值。以金氏单位(0.1 L液体在37 ℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个金氏单位)表示其活性，计算公式：

ALP活力=测定OD值-空白OD值/标准OD值-空白OD值×酚标准品浓度(0.02 g/L)×0.1 L×样本稀释倍数

1.3统计学分析

2结果

2.1成骨细胞鉴定

倒置相差显微镜下：原代细胞贴壁生长，呈梭状、三角形、不规则形，可见数量不等、长短不一的突起，部分区域呈重叠、放射生长(图1A)；第3代细胞体积增大，胞质丰富，细胞突起伸展呈梭形、不规则形等典型的OB形态(图1B)；ALP染色见胞质中含灰黑色颗粒或条块状沉淀，胞核染成蓝紫色(图1C)；茜素红染色见连续培养至第21天的第3代OB融合呈叠状生长，形成的钙结节，染色呈橘红色(图1D)。

注：A为原代OB培养第5天，B为第3代OB培养第5天，C为第3代OB ALP染色，D为第3代OB培养至第21天茜素红染色图1　体外培养的OB形态学观察及鉴定(100×)Fig.1　The morphological observation and identification of osteoblasts cultured in vitro

2.2TsⅡ-A对OB增殖的影响

CCK-8检测结果显示，各实验组TsⅡ-A均可促进OB增殖；与对照组比较，5×10-2mg/L、5×10-1mg/L浓度组在第1 、3 、5 天对OB的促增殖作用显著(P<0.05)，其中5×10-2mg/L浓度组促增殖作用最为显著；5×10-3mg/L浓度组在第3 、5 天对OB的促增殖作用显著(P<0.05)；各实验组在第7 天时间点对OB的促增殖作用与对照组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　不同浓度TsII-A对OB增殖的影响(OD值，

(1)与对照组比较，P<0.05

2.3ALP活性

对照组及实验组比较，培养OB至第5天时实验组中ALP活性高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2　TsII-A对ALP活性的影响

3讨论

丹参提取于唇形科鼠尾草属植物的干燥根及根茎，是活血化淤类传统中药，常用于骨折治疗，具有强骨补肾的作用，是中医骨伤科方剂中的常用药。丹参可提高大鼠OB的ALP活性，对OB具有促细胞增殖和分化的作用[8]。相关研究表明丹参亦可加强成骨细胞样细胞合成和分泌骨质基质，从而促进钙盐沉积及骨组织形成，加快骨折的愈合速度[9]。TsII-A是丹参中主要有效成分之一,为脂溶性樱红色针状结晶，除具备传统的活血调经、祛瘀止痛、养心安神之功效外，还具有抗肿瘤、天然抗氧化、心血管药理作用、雌激素样活性、抗菌消炎和促骨代谢等药理作用[6]。有学者研究发现 ，TsII-A在BMP-2 诱导下，能促进双潜能间充质前体细胞C2C12分化为OB[10]。

目前，相关研究确认OB富含ALP，具有长时间体外培养能发生矿化、形成钙结节、表达骨钙素等典型特征，是长期以来作为OB鉴定的主要依据。本实验采用酶消化法获取大量SD大鼠乳鼠颅盖骨的OB，通过细胞形态观察、ALP染色(钙钴法)和钙结节染色鉴定，结果显示SD大鼠乳鼠颅盖骨体外分离培养出的细胞具有OB典型的形态学及生物学特征，符合本实验研究需要。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种无放射性的比色检测法，CCK-8试剂可直接加入到细胞样品中，具有操作简易、敏感度高、结果客观可靠等优点。本实验采用CCK-8法检测在不同浓度TsII-A的作用下对OB体外增殖的影响，结果显示，5×10-3mg/L、5×10-2mg/L及5×10-1mg/L浓度的TsII-A均可促进OB增殖，其中5×10-2mg/L浓度组促细胞增殖作用最明显，说明该药物浓度为本实验最适宜作用浓度，提示适宜浓度TsII-A具有促进体外培养的SD大鼠乳鼠颅盖骨OB增殖的作用。ALP是OB成熟的重要标志酶之一 ，定量检测ALP的活性可以客观地反映OB的分化水平，ALP活性越高，说明OB分化越成熟，本实验ALP活性检测结果显示，对照组及实验组比较，培养OB至第5天时实验组中ALP活性高于对照组(P<0.05)，提示了TsII-A对OB具有促进细胞分化成熟作用。

近年来有学者把TsII-A应用到探讨加速正畸牙移动机理研究中,杨夏晴等[11]研究发现，在家兔正畸牙移动过程中，口腔局部注射适量TsII-A可有效的促进牙槽骨改建，从而加快正畸牙移动速度。口腔正畸治疗的生物学基础主要体现在颌骨及牙槽骨的可塑性，即颌骨及牙槽骨的增生和吸收两个过程。正畸牙的移动过程中，骨组织的塑建最为重要[12]，骨塑建的快慢直接影响着牙齿移动速度，以致影响到正畸矫治疗程。正畸矫治力作用下牙槽骨的改建和骨折愈合中骨的改建同样涉及到OB新生和新骨沉积，OB的发生、增殖、分化和成熟与颌骨、牙槽骨塑建密切相关。本实验初步研究了TsII-A对OB的直接作用，结果表明，适宜浓度的TsII-A在一定的作用时间内，对体外培养的OB具有较明显的促增殖分化作用，说明TsII-A可能通过促进OB增殖分化和成熟来达到促进骨改建，从而影响正畸牙齿的移动，这为正畸治疗过程中加速牙移动的临床研究奠定了理论基础。TsII-A促进OB增殖分化的具体机制有待进一步深入研究。

4参考文献

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[10]Joo KH，Hwan KS.Tanshinone IIA enhances BMP-2-stimulated commitment of C2C12 cells into osteoblasts via p38 activation [J].Amino Acids， 2010(5)：1217-1226.

[11]杨夏晴，张军梅，王薮馨，等.局部注射丹参酮IIA对兔正畸牙移动中破骨细胞的影响[J].贵阳医学院学报， 2015(10)：1054-1059.

[12]陈扬熙.口腔正畸学-基础、技术与临床[M].北京：人民卫生出版社, 2013：98-110.

(2016-01-08收稿，2016-03-21修回)

中文编辑： 周凌； 英文编辑： 刘华

Effect of Tanshinone Ⅱ-A on Proliferation and Differentiation of Rats' Osteoblastinvitro

MO Chaolun, ZHANG Junmei, JIA Ying, WANG Souxin, WU You, LIU Miao, ZHANG Fengdan

(DepartmentofStomatology,theAffiliatedHispitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of Tanshinone Ⅱ-A(TsII-A) on the proliferation and differentiation of rat osteoblast(OB) in vitro. Methods: Infant rats' calvarial OB were isolated, cultured and purified in vitro, and passed to the third generation. The morphological changes and physiologic characters of the third generation OB were observed by inverted microscope. The third generation OB were divided into experimental group and control group. The experimental group was treated by different concentrations of TsII-A while control group were given equal amounts of pure DMEM culture medium. Then the effects of TsII-A on the proliferation and differentiation of rats' OB on the 1stday, the 3rdday, the 5thday, and the 7thday, were observed respectively. The alkaline phosphatase (ALP) activities of OB were determined 5 days after inoculation. Results: The morphological characters of isolated and cultured cells accorded with those of OB. Different concentrations of TsII-AT had significant promotion effects on OB proliferation, of which the 5×10-2mg/L of TsII-AT showed the maximum promotion effect (P<0.05). The ALP activities of experimental group were significantly higher than those of control group 5 days after inoculation (P<0.05). Conclusion: TsII-A has the promotion effect on OB proliferation and differentiation in vitro within certain period of time.

[Key words]tanshinone Ⅱ-A; osteoblast; alkaline phosphatase; proliferation and differentiation; orthodontics; tooth movement

[中图分类号]R783.5

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)04-0391-04

*[基金项目]贵阳市科技局基金[筑科合同(20151001)]

**贵州医科大学2013级硕士研究生

***通信作者 E-mail:zjm46688@126.com

网络出版时间：2016-04-20网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1811.022.html