柴胡疏肝散对抑郁大鼠海马微管相关蛋白-2磷酸化的影响*

刘继刚， 袁　杨， 臧　蔚， 刘　昊**

(1.遵化市人民医院 口腔科， 河北 遵化　064200； 2.华北理工大学附属医院 神经内科， 河北 唐山　063000)



·基础研究·

柴胡疏肝散对抑郁大鼠海马微管相关蛋白-2磷酸化的影响*

刘继刚1， 袁杨2， 臧蔚2， 刘昊2**

(1.遵化市人民医院 口腔科， 河北 遵化064200； 2.华北理工大学附属医院 神经内科， 河北 唐山063000)

[摘要]目的： 探讨柴胡疏肝散对抑郁大鼠海马组织微管相关蛋白-2(MAP-2)磷酸化的影响。方法： 成年雄性Wistar大鼠45只，随机均分为对照组、模型组和治疗组；模型组和治疗组采用慢性不可预性温和应激建立抑郁症大鼠模型，治疗组同时经灌胃给予柴胡疏肝散治疗，持续22 d；采用糖水实验、高架十字迷宫实验和Morris水迷宫实验观察各组大鼠行为学变化，Western blot方法检测各组大鼠海马组织MAP-2及磷酸化MAP-2(pMAP-2)表达，Real-time PCR检测pMAP-2 mRNA表达。结果： 与对照组比较，模型组大鼠糖水偏好百分比明显降低，进入开臂次数和停留时间百分比增高，水迷宫逃避潜伏期延长，海马pMAP-2蛋白和mRNA表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，治疗组大鼠糖水偏好百分比明显增高，进入开臂次数和停留时间百分比降低，水迷宫逃避潜伏期减少，海马pMAP-2蛋白和mRNA表达水平明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论： 柴胡疏肝散具有显著的抗抑郁作用，该作用可能与影响海马MAP-2磷酸化有关。

[关键词]柴胡疏肝散； 抑郁症； 海马； 微管相关蛋白； 大鼠，wistar

反复的应激是导致抑郁症(depression)发生的根本原因，其核心症状是兴趣感缺失、记忆力减退等，抑郁症发病率高，社会危害较大。大量研究表明，海马神经元体积萎缩，特别是微管相关蛋白(microtubule-associated protein 2, MAP-2)的变化可能是抑郁症重要的病理生理过程[1-2]。中医认为抑郁症是由于情志不舒，肝气郁结所致，多采用疏肝理气法对其进行治疗[3]。柴胡疏肝散是中医临床上治疗肝郁证的常用方剂，能明显改善抑郁症的临床症状，但其具体机理尚不清楚[4]。本研究建立抑郁症大鼠模型，观察柴胡疏肝散对大鼠行为学和海马组织MAP-2磷酸化的影响，探讨柴胡疏肝散抗抑郁作用机理。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物雄性Wistar大鼠45只，2月龄，体重180～210 g，清洁级，由华北理工大学实验动物中心提供(SCXK京2009-0004动物合格证号)。常规适应性饲养1周后用于实验，饲养条件室温18～28 ℃，湿度60%～80%。

1.1.2药品与试剂兔抗鼠MAP-2、兔抗鼠pMAP-2抗体购自Santz Cruz公司，Western blot相关试剂购自武汉博士德生物工程有限公司，逆转录试剂盒购自Takara公司。柴胡疏肝散饮片由河北省中药材公司提供，饮片按照柴胡6 g，白芍4.5 g，枳壳4.5 g，川芎4.5 g，醋炒陈皮6 g，香附4.5 g，炙甘草1.5 g组方。将各味药清水浸泡1 h，砂锅煎煮至沸后至少20 min，使其终浓度为每毫升药液含原生药1 g。

1.2方法

1.2.1分组将大鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组15只。按文献[4]方法给予大鼠慢性不可预见性温和应激(CUMS)制作抑郁症大鼠模型。治疗组在造模同时，给予大鼠柴胡舒肝散，每日灌胃1次(每毫升药液含原生药1 g，剂量1 mL/100 g体质量)，其他两组给予等体积生理盐水。造模及给药持续22 d，结束后24 h处死大鼠。对照组不作特殊处理。

1.2.2糖水偏好实验实验前禁止饮水2.5 h，实验时分别用10%蔗糖水和自来水给大鼠供饮，测量大鼠1 h内的蔗糖水和自来水消耗量，计算糖水偏好百分比(糖水消耗量/总液体消耗×100%)。

1.2.3高架十字迷宫实验分别将3组大鼠置于高架十字迷宫中央区，头朝开臂。通过动物行为视频分析系统记录分析5 min内大鼠的活动情况。检测大鼠进入开臂次数百分比和在开臂滞留时间百分比。

1.2.4Morris水迷宫实验每组取5只大鼠，利用鼠博士行为学分析系统进行定位航行实验，记录大鼠60 s内找到水下平台的时间(逃避潜伏期)。

1.2.5MAP-2和pMAP-2表达Western blot检测海马MAP-2和pMAP-2表达。每组各取大鼠5只，麻醉后断头取脑，快速分离海马，提取组织总蛋白，按照30 μg蛋白量上样， 10% SDS-PAGE电泳，PVDF膜电转印，脱脂奶粉封闭，MAP-2一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜，二抗IgG(1∶5 000)室温孵育1 h，ECL显色，同样方法进行pMAP-2和内参照β-actin的SDS-PAGE电泳和显色。以目的条带与内参照的光密度比值表示蛋白相对表达。

1.2.6pMAP-2 mRNA表达Real-time PCR检测pMAP-2 mRNA表达。每组大鼠各取5只，麻醉后断头取脑，冰上快速分离海马组织，提取总RAN。定量后取1 μg总RNA，按照试剂盒说明书进行反转录和PCR 扩增。pMAP mRNA引物序列：sense 5′-TGG CTT TCT CAT CTC CAT CC-3′，antisense 5′-CTC ACT GCC CCA TTA GTG C-3′，产物大小357 bp。管家基因β-actin引物序列：sense5′-CTT CTG AGT GGC AGT GAT GG-3′，antisense 5′-TGG CAC AGT CAA GGC TGA GA-3′，产物大小389 bp。PCR扩增条件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 25 s(35个循环)。按照公式ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(管家基因)、ΔΔCt=ΔCt(实验组)-ΔCt(对照组)计算2-ΔΔC t(代表pMAP-2 mRNA水平)。

1.3统计学处理

2结果

2.1行为学实验

糖水偏好实验结果表明，模型组糖水偏好百分比明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组低于对照组，但高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。高架十字迷宫实验显示，模型组大鼠进入开臂次数百分比和在开臂停留时间百分比明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组低于对照组，高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。Morris水迷宫实验结果显示，模型组大鼠逃避潜伏期明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组高于对照组，低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　3组大鼠行为学检测结果

(1)与对照组比较，P<0.05；(2)与模型组比较，P<0.05

2.2海马组织MAP-2和pMAP-2蛋白表达

Western blot结果表明，模型组大鼠海马组织pMAP-2与MAP-2比值明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组低于对照组，高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1和表2。

图1　海马MAP-2和pMAP-2表达(Western blot)Fig.1　Expressions of MAP-2 and pMAP-2 in hippocampus tissue detected by Western blot

组别pMAP-2MAP-2pMAP-2/MAP-2对照组0.94±0.11 1.05±0.120.90模型组0.18±0.02(1)1.18±0.200.15(1)治疗组0.43±0.05(1)(2)0.71±0.08(1)(2)0.61(1)(2)

(1)与对照组比较，P<0.05；(2)与模型组比较，P<0.05

2.3海马组织pMAP-2 mRNA表达

Real-time PCR结果表明，模型组大鼠海马pMAP-2 mRNA相对表达量明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组低于对照组，高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

(1)与对照组比较,P<0.05；(2)与模型组比较,P<0.05图2　3组大鼠海马组织pMAP-2 mRNA表达(Real-time PCR)Fig.2　Expressions of MAP-2 and pMAP-2 in hippocampus tissue detected by Real-time PCR

3讨论

当今社会，随着生活压力的增加，抑郁症发病率有增高趋势[5]。但由于抑郁症确切发病机制尚未明确，因此对抑郁症的治疗尚缺乏有效的根治方案。中医认为抑郁症是由于情志不舒，肝气郁结所致，中医药对抑郁症的疗效也逐渐得到人们的认可。中医还认为，抑郁症属“郁证”范畴，是情志不舒，肝气郁结，渐致五脏不和，化火、生痰、瘀阻、耗气、伤阴等而致。根据中医对症治疗原则，中医临床上多采用疏肝理气法对抑郁症进行治疗，常用方剂之一是柴胡疏肝散[3]。柴胡疏肝散由柴胡、陈皮、川芎、香附、枳壳、芍药、炙甘草等7味药组成，能发挥疏肝解郁、行气止痛作用，主治肝气郁滞诸症。中医临床研究表明，柴胡疏肝散对肝郁气滞、气血不合之证多有效验[6-8]。

本研究首先检测了柴胡疏肝散对大鼠行为学的影响。结果显示，与模型组比较，经过柴胡疏肝散治疗后，大鼠糖水偏好百分比、高架十字迷宫开臂次数百分比及开臂时间百分比明显升高，Morris水迷宫逃避潜伏期显著降低，提示柴胡舒肝散能明显减轻抑郁症大鼠的兴趣感缺失、焦虑症状、记忆力减退等临床症状，对抑郁症大鼠具有较明显的治疗作用。MAP，即微管相关蛋白，能调节细胞骨架微管的聚合与解离状态，在维持神经元形态和突触可塑性方面发挥重要作用[9-10]。随着影像技术的发展，对抑郁症患者脑结构改变的研究取得显著进展，能直接观察到抑郁症患者存在海马部位结构与功能异常[11]。同样的研究结果在动物实验中也得到验证[12]。为进一步探讨柴胡疏肝散的作用机理，本研究进一步检测了大鼠海马MAP-2及其磷酸化的改变。结果表明抑郁症大鼠海马组织中pMAP-2与MAP-2比值显著降低，提示MAP-2蛋白磷酸化增强可能是抑郁症发病的一个重要环节。这与隋竹欣等的研究结果相一致[2]。课题组进一步研究发现，抑郁症大鼠经过柴胡疏肝散治疗后，MAP-2蛋白磷酸化降低现象得到显著逆转，pMAP-2与MAP-2比值明显高于模型组，但仍低于对照组(P<0.05)。mRNA水平检测结果与蛋白质结果相一致。综合实验结果提示，柴胡疏肝散能影响抑郁症海马组织MAP-2磷酸化，这可能是其抗抑郁作用的机理之一。但使用柴胡疏肝散治疗后，MAP-2蛋白磷酸化程度仍然低于对照组，提示影响MAP-2磷酸化的还有其他因素，值得进一步研究。

4参考文献

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(2016-01-25收稿，2016-03-19修回)

中文编辑： 刘平； 英文编辑： 刘华

Influence of Bupleurum Liver-Coursing Powder on Phosphorylatied Microtubule-Associated Protein-2 in Hippocampus of Depressive Rats

LIU Jigang1, YUAN Yang2, ZANG Yu2, LIU Hao2

(1.DepartmentofStomatology,ZunhuaPeople'sHospital,Zunha064200,Hebei,China; 2.DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,Hebei,China)

[Abstract]Objective: To observe the influence of bupleurum liver-coursing powder on phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (pMAP-2) in hippocampus of depressive rats. Methods: Forty-five male Wistar rats were randomly divided into control group, model group and treatment group. The depression animal model was produced by giving the rats chronic unpredicted mild stress and treatment group received intragastric administration of bupleurum liver-coursing powder for 22 days. The sucrose preference test, elevated plus maze test and Morris water maze test were adopted to observe behavioral changes of rats in each group. The expression of pMAP-2 protein and mRNA were detected by western blot and real-time PCR respectively. Results: Compared with control group, sucrose preference percentage of model group was significantly lower, the number of entry into open arms and percentage of detention time extended significantly, the escape latency of Morris water maze test increased significantly, and the expression of pMAP-2 protein and mRNA were decreased significantly (P<0.05). Compared with model group, sucrose preference percentage of treatment was significantly higher, the number of entry into open arms and percentage of detention time decreased significantly, the escape latency of Morris water maze test decreased significantly, and the expression of pMAP-2 protein and mRNA were increased significantly (P<0.05). Conclusion: Bupleurum liver-coursing powder has a significant anti-depressant effect, and its mechanism may be relavent to its effect on the phosphorylation of MAP-2 in hippocampus.

[Key words]bupleurum liver-coursing powder; depression; hippocampus; microtubule-associated protein; rats,wistar

[中图分类号]R285.5

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)04-0387-04

*[基金项目]国家自然科学基金(81201048)

**通信作者 E-mail:liuhao938@163.com

网络出版时间：2016-04-20网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1857.060.html