新型纳米载体PEI-Fe3O4在鼻咽癌细胞基因转染中的应用*

邓　雯， 吴维敏， 亓立峰， 赵厚育

(1.贵州医科大学， 贵州 贵阳　550004； 2.同济大学医学院附属同济医院 妇产科， 上海　200000； 3.同济大学医学院 纳米院， 上海　200000； 4.贵州医科大学附院 耳鼻喉科， 贵州 贵阳　550004)



新型纳米载体PEI-Fe3O4在鼻咽癌细胞基因转染中的应用*

邓雯1， 吴维敏2， 亓立峰3， 赵厚育4**

(1.贵州医科大学， 贵州 贵阳550004； 2.同济大学医学院附属同济医院 妇产科， 上海200000； 3.同济大学医学院 纳米院， 上海200000； 4.贵州医科大学附院 耳鼻喉科， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 构建聚乙烯亚胺(PEI)修饰的四氧化三铁(Fe3O4)磁性纳米粒,观察其表征，探讨其作为基因载体的可行性。方法： 用PEI-Fe3O4磁性纳米粒包被质粒转染鼻咽癌CNEII细胞，转染miRNA-HIF-1α干扰质粒和miRNA-NC对照质粒分别为H组、NC组，空白对照组设为C组；用电子显微镜观察H组和NC组纳米粒的大小及表征，用荧光显微镜观察H组和NC组转染效率，用Real Time RT-PCR及Western Blot方法检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA及蛋白表达的抑制情况。结果： 成功构建PEI-Fe3O4磁性纳米粒；H组和NC组的转染率分别为(63.6±4.2)%、(65.8±6.1)%，差异无统计学意义(P>0.05)；H组HIF-1α mRNA及蛋白表达抑制率与NC组、C组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论： PEI-Fe3O4磁性纳米粒是一种较为理想的基因转染载体。

[关键词]乙烯亚胺-四氧化三铁； 磁性纳米粒； 基因转染； 鼻咽癌； 缺氧诱导因子- 1α； 信使RNA

聚乙烯亚胺(poly ethylene imine，PEI)是一种水溶性的阳离子聚合物，是一种常被用做药物投递系统的经典非病毒载体，其转染效率已被证实比大多数阳离子聚合物高[1]。四氧化三铁(Fe3O4)是较为经典的磁性纳米材料，具超顺磁性，粒径小，经PEI修饰的Fe3O4水溶性磁流体，也被证实可应用于药物投递、靶向基因治疗，及生物医学领域的多种研究[2-3]。因此，PEI-Fe3O4在鼻咽癌细胞的研究中可能成为一种理想的基因转染载体。本研究拟将包被了干扰质粒的PEI-Fe3O4磁性纳米粒转染到鼻咽癌CNEII细胞中，观察转染后的各项指标，为纳米材料作为新型基因治疗载体在鼻咽癌细胞中应用的可能性提供依据。

1实验方法

1.1试剂及主要仪器

FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、PEI购于上海朗顺化工有限公司，RP1640培养液、胎牛血清购于invitrogen公司，低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)抗体、Tubulin抗体及相关二抗均购于美国ABcam公司，小RNA(microRNA,miRNA)干扰质粒购于上海吉玛公司，PCR试剂盒购于invitrogen公司。恒温水浴锅，电子称量器，机械搅拌器购于德国Memmert公司，电泳仪及垂直电泳槽购于美国BioRad公司，荧光显微镜购于OLYMPUS公司，高速离心机购于Eppendorf公司，RT-PCR仪购于美国Biorad公司。

1.2干扰质粒

本研究所用干扰质粒购于上海吉玛公司，miRNA-HIF-1α干扰质粒的靶序列为5′-GCAGGTCATAGTTTTGGCCACTG-3′，NC对照质粒的靶序列为5′-AAATGTACTGCGCGTGGAGAC-3′。各质粒均带有绿色荧光蛋白(EGFP)。

1.3细胞培养与分组

鼻咽癌细胞株CNEII由上海复旦大学亓立峰教授实验室赠与。于含有10%胎牛血清的RP1640培养液中，于37 ℃，5% CO2恒温培养箱中常规培养，每2～3 d传代1次。细胞分为3组，未转染的CNEII细胞设为空白对照组(C组)；利用合成的纳米颗粒PEI-Fe3O4转染miRNA-HIF-1α干扰质粒及NC对照质粒分别设为H组及NC组。在细胞生长良好的情况下，以约1×105密度接种于六孔板中，待细胞完全贴壁，细胞密度达40%时利用转染介质转染相应质粒进行干预处理。

1.4PEI-Fe3O4纳米载体的制备

取8 mmol水杨酸与10 mL水混合，用1 mol/L NaOH中和水杨酸，并调PH值为11。称取FeCl20.254 g，FeCl30.65 g，分别溶于5 mL水。将FeCl2、FeCl3溶液加入到配置好的水杨酸溶液中，溶液变成黑色，在氮气保护下，冷凝回流，机械搅拌，90 ℃条件下反应4 h。吸取PEI6.0 g，用10000透析袋透析2 d，每4～5 h换1次水，透析除去杂质。最后收得25000PEI 9.25 mmol/L。取PEI 10 mmol/L、Fe3O41 mmol/mL等体积涡旋混匀，即得。用电子显微镜观察H组和NC组纳米粒的大小及表征。

1.5转染效率的检测

在CNEII细胞生长良好的情况下，以约1×105密度接种于六孔板中，待细胞完全贴壁，细胞密度达40%时利用不同转染介质转染相应质粒进行干预处理。待转染48 h后予荧光显微镜下观察质粒所带EGFP的表达情况，进行细胞计数，计算转染效率。

1.6转染后CNEII细胞HIF-1α蛋白表达抑制

Western Blot检测转染后CNEII细胞HIF-1α蛋白表达抑制情况。在转染后72 h收集细胞，常规PBS洗涤后提取蛋白，12%及8%聚丙酰胺凝胶恒压分离蛋白，常规转膜及封闭后加入HIF-1α一抗(1∶2 000)、及Tubulin一抗(1∶5 000)4 ℃过夜孵育，经过常规TBST洗涤后加入相应二抗室温孵育1 h，显影、定影、洗涤后观察结果，计算抑制率，抑制率=(对照组相对灰度值-干扰组相对灰度值)/对照组相对灰度值×100%。

1.7转染后CNEII细胞HIF-1α蛋白表达抑制

Real Time RT-PCR检测转染后CNEII细胞HIF-1α蛋白表达抑制情况。在转染后48～72 h收集细胞，提取总RNA，HIF-1α基因上游引物序列为5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′，下游引物序列为5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′。以β-actin作为对照。RT-PCR反应条件为：95 ℃ 1 min; 95 ℃ 10 s; 60 ℃ 10 s; 70 ℃ 10 s，共40个循环；70 ℃ 10 min。实时荧光定量检测mRNA表达，计算抑制率，抑制率=(对照组2-ΔΔCT值-干扰组2-ΔΔCT值)/对照组2-ΔΔCT值×100%。

1.8统计学方法

2结果

2.1纳米载体形态

电镜下观察不同放大倍数PEI-Fe3O4磁性纳米尺寸在100 nm，粒子似球形，分散性好，见图1。

2.2纳米载体转染效率

NC组、H组的转染率分别为(65.8±6.1)%、(63.6±4.2)%，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图1　PEI-Fe3O4磁性纳米粒(×300 000)Fig.1　Electron microscope pictures of PEI-Fe3O4 nanoparticles

注：A为转染NC对照质粒，B为转染HIF-1α干扰质粒图2　CNEII细胞转染NC或HIF-1α后的光镜及荧光图片的转染情况(40×)Fig.2　Light and fluorescent microscope pictures of group CNEII cell transfection NC or HIF-1α

2.3转染后HIF-1α蛋白表达

H组蛋白表达抑制率为69.4%，与NC组、C组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

(1)与C组比较，P<0.05；(2)与NC组比较，P<0.05图3　CNEII细胞转染miRNA-HIF-1α质粒后蛋白的表达Fig.3　Expression of protein levels of CNEII cells after transfected with miRNA-HIF-1α plasmid

2.4转染后HIF-1α mRNA表达

H组HIF-1αmRNA表达抑制率为63.0%，与C组及NC组比较,差异具有统计学意义(P>0.05)，见图4。

(1)与C组比较，P<0.05；(2)与NC组比较，P<0.05图4　CNEII细胞系转染miRNA-HIF1α质粒后目的基因mRNA表达Fig.4　Expression of HIF-1α mRNA levels of CNEII cells after transfected with plasmids

3讨论

基因治疗是治疗癌症及其他病症的常用研究手段，而要将外源性基因导入到靶细胞中则必须要有载体的帮助，经典的载体包括病毒载体和非病毒载体，病毒作为载体有其独特的优势，其在靶细胞内表达稳定，转染率高，但其免疫原性、细胞毒性反应可对靶细胞造成进一步伤害。有报道称病毒载体有潜在的致基因突变的作用，这使病毒载体在临床中的应用被限制[4]。通常非病毒载体主要是指脂质体(Lipofectamine)，相比于病毒载体而言，其具有方便获取、无毒的特点，是一种方便快速的转染载体，在体外研究时可发挥快速准确的作用，但是其对细胞具有毒性作用，限制了其在体内研究甚至临床试验中的广泛应用[5]。

纳米材料作为一种新型的生物材料，近年来已被广泛应用到医学、生物、化学等领域，其低毒性、无免疫原性等特点在医学领域有着令人瞩目的潜能，被应用于基因治疗、药物投递系统、增加灵敏性检测等领域的研究[6-8]。在胰腺癌细胞、肝癌细胞等癌细胞系中，纳米颗粒已被证实可以作为RNA干扰的载体成功影响细胞系的生物学效应[9-11]。有报道称纳米材料作为载体负载小RNA分子(small interfering RNA，siRNA)转染到活细胞时，相比于lipofectamine，在敲除相同基因的目的下，能更好的保护siRNA不被降解，同时具有更好的细胞膜穿透性[12-13]。

常用的纳米载体包括壳聚糖、白蛋白等。磁性纳米粒在磁场中具有良好的响应性及导向性，不仅在药物投递等传统方法中发挥作用，也使其在核磁成像的诊断中发挥作用[14]。磁性纳米粒不仅可用于转染等基因治疗，其亦可包裹化疗药物，通过纳米粒表面配体的设计，使其更好的靶向性导入肿瘤细胞，实现放化疗治疗的一体化。本实验曾使用多种纳米材料，如壳聚糖等作为转染介质，因其转染率低而改为PEI-Fe3O4磁性纳米粒，考虑一是因为细胞类型，各种纳米载体对其亲和力不同，二是因PEI可以包裹DNA穿过细胞膜而进入细胞，加之Fe3O4毒性较小，故最终选用PEI-Fe3O4磁性纳米粒。本实验中所使用的PEI-Fe3O4磁性纳米粒采用传统方法合成，其稳定性好，分散性佳，具超顺磁性。作为载体在鼻咽癌细胞中能有较高的转染率，Real Time RT-PCR及Western Blot检测结果表明，包被miRNA-HIF-1α质粒的PEI-Fe3O4磁性纳米粒能有效抑制HIF-1αmRNA及蛋白的表达。

本研究首次在鼻咽癌细胞中应用PEI-Fe3O4磁性纳米粒作为载体转染干扰质粒，并在体外证实了其能有效转染鼻咽癌细胞，虽然目前尚缺乏体内实验的研究，其效率及后续生物学作用仍有待于后续体内实验进一步探索，但PEI-Fe3O4磁性纳米粒作为载体，其无免疫原性、细胞毒性等的特点无疑将成为体内实验中的闪光点。

4参考文献

[1] 刘永泽,周函,高下,等.PEI一质粒纳米粒子对体外培养新生C5 7BL/6J小鼠耳蜗基底膜转染效果观察[J]．听力学及言语疾病杂志， 2014(3)：290-295.

[2] 蔡元元,高福平,唐劲天,等.PEI修饰磁性Fe3O4纳米粒的制备和表征[J]．科技导报， 2010(19)：68-72.

[3] 陈月,陈宝安．磁性氧化铁纳米颗粒在肿瘤靶向治疗中的应用及进展[J]．癌症， 2010(1)：125-128.

[4] Endo T, Nakagawa T, Kha T, et al．Novel strategy for treatment of inner ears using a biodegradable gel[J]．Laryngoscope， 2005(11)：2016-20.

[5] 孙聚魁,邓英杰,曹金娜.纳米脂质体研究进展[J].沈阳药科大学学报， 2010(12)：993-997.

[6] BlancoE, Hsiao A, MannAP, et al. Nanomedicinein in cancer therapy：innovative trends and prospects[J]．Cancer Science， 2011(7)：1247-1252．

[7] McNeeley KM, Karathanasis E, Annapragada AV, et al. Masking and triggered unmasking of targeting ligands on nanocarriers to improve drug delivery to brain tumors[J]．Biornateriah， 2009(23-24)：3986-3995．

[8] 李琚，李晓桐，赵明. 无机纳米材料及其在生物医学方面的应用研究[J].医疗卫生装备， 2015 (7)：97-101,105.

[9] 朱青云,潘新亭,滕金龙，等.白蛋白纳米载体的构建及其转染胰腺癌细胞潜能的可行性[J].山东医药， 2013(41)：8-10.

[10]潘新亭,朱青云,韩冰,等.Survivin siRNA纳米载体的制备及其对胰腺癌细胞生物学特性的影响[J]．中国现代普通外科进展， 2012 (4)：253-257.

[11]潘一峰,张阳德,王渊璟,等.PLGA纳米载体介导的端粒酶反义核酸体外转染率及对肝肿瘤细胞的影响[J].中国现代医学杂志， 2005 (23)：3540-3543.

[12]Lifeng Qi，Xiaohu Gao. Quantum dot-amphipol nanocomplex for intracellular delivery and real-time imaging of siRNA[J].ACS Nano， 2008 (7)：1403-1410.

[13]Qi L, Wu L, Cui D, et al. Cell-penetrating magnetic nanoparticles for highly efficient delivery and intracellular imaging of siRNA[J].Biomacromolecules， 2012 (9)：2723-2730.

[14]Lakshmanan S, Gtpta G K, Avci P, et al．Physical energy for drug delivery; poration, concentration and activation[J]．Adv Drug Deliv Rev， 2014 (3)：98-114．

(2016-01-03收稿，2016-04-08修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 周凌

Application of PEI-Fe3O4Nanoparticles as Novel Carrier in Gene Transfection in Nasopharyngeal Carcinoma

DENG Wen1, WU Weimin2, QI Lifeng3, ZHAO Houyu4

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004，Guizhou，China； 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics，TongjiHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofTongjiUniversity,Shanghai200000，China； 3.InstituteofBiomedicalEngineeringandNanoScience，MedicalCollegeofTongjiUniversity,Shanghai200000，China； 4.DepartmentofOtorhinolaryngology，theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004，Guizhou，China)

[Abstract]Objective: To construct PEI-Fe3O4 nanoparticles and observe its characteristics, and to investigate the feasibility of PEI-Fe3O4 nanoparticles as carrier in transfection. Methods: Plasmids coated with PEI-Fe3O4 magnetic nanoparticels were transfected into CNEII cells, cells transfected with miRNA-HIF-1α plasmid as group H while cells transfected with miRNA-NC plasmid as NC group, and CNEII cells without transfection served as C group. Observing size and morphology of PEI-Fe3O4 nanoparticles with scanning electronic microscope. Using fluorescence microscope to measure efficiency of transfection. Proteins were detected by western blot and mRNAs were detected by RT-PCR. Results: PEI-Fe3O4 was successfully constructed. The transfection efficiency of group H and group NC was (63.6±4.2)% and (65.8±6.1)%,difference was not statistically significant(P>0.05). The difference of suppression ratio of protein and mRNA of HIF-1α was significant compared to group C and group NC(P<0.05). Conclusion: PEI-Fe3O4 magnetic nanoparticles can be used as an ideal carrier of gene transfection.

[Key words]PEI-Fe3O4 magnetic nanoparticles； gene transfection； nasopharyngeal carcinoma； hypoxia inducible factor-1α； message RNA

[中图分类号]R34-33; R739.6

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)04-0382-05

*[基金项目]国家自然科学基金地区科学基金项目(NO.81260353)

**通信作者 E-mail:zhaohouyujia@163.com

网络出版时间：2016-04-20网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1755.008.html