麦胚凝集素慢病毒载体的构建及其表达的研究

王　娟　张连国　马　云　卞伟华

1 滨州医学院药学院细胞工程教研室　烟台　264003；2 滨州医学院附属医院胸外科；3 滨州医学院附属医院中心实验室；4 滨州医学院药学院细胞生物学教研室



麦胚凝集素慢病毒载体的构建及其表达的研究

王娟1张连国2马云3卞伟华4

1 滨州医学院药学院细胞工程教研室烟台264003；2 滨州医学院附属医院胸外科；3 滨州医学院附属医院中心实验室；4 滨州医学院药学院细胞生物学教研室

【摘要】目的探讨麦胚凝集素慢病毒载体的构建与表达的方法。方法采用基因工程方法，将麦胚凝集素的基因插入慢病毒表达载体Plvx-IRES-ZsGreen1中。再采用慢病毒包装，将构建好的质粒和其他三种包装质粒(RPEV、PRRE、VSVG)在293T细胞中进行共转染，获取病毒液后感染人源的脂肪干细胞(ADSC)。结果显微镜下显示绿色荧光报告蛋白表示感染成功。对感染后的脂肪干细胞运用免疫染色技术进行显色，结果显示麦胚凝集素已经成功在脂肪干细胞中实现表达。结论慢病毒包装WGA蛋白的方法可靠高效，可作为一种高效的示踪技术广泛应用于各类细胞。

【关键词】麦胚凝集素；慢病毒载体；免疫荧光染色；脂肪干细胞

麦胚凝集素(wheat germ agglutinin，WGA)是一种可凝集细胞的蛋白质，可以从多种谷类中提取[1]。WGA可介导体内多种生理过程，其通过诱导细胞膜表面上的糖类和蛋白质的相互作用参与了宿主细胞被细菌和病毒感染的初始步骤、胚胎发育中的细胞分化过程以及肿瘤转化相关过程[2，3]，其对生物化学、细胞生物学、免疫学、组织器官学以及医学研究都有重要意义。本研究是运用脂肪干细胞(ADSC)进行细胞疗法，观察其对脊髓损伤的治疗效果，前期的工作是运用基因工程的方法将麦胚凝集素导入到慢病毒载体Plvx-IRES-ZsGreen1中，再用慢病毒包装，将构建好的质粒和其他三种包装质粒(RPEV、PRRE、VSVG)在293T细胞中进行共转染，获取病毒液后感染人源ADSC，以达到追踪的目的，为其分化治疗提供显色追踪的方法。

1材料与方法

1.1材料293T细胞(人胚肾细胞)、ADSC细胞(人源脂肪干细胞)、DH5α感受态细胞、WGA-d质粒、plvx-ires-ZsGreen1载体质粒(均为滨州医学院生物技术实验室提供)；DMEM培养基、DMEM/F12培养基、磷酸盐缓冲液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(均为美国Gibco公司产品)；Sorvall ST 16R高速冷冻离心机(ThermoFisher)，Sorvall Legend Micro 17R微量高速冷冻离心机(Thermo Scientific)，PowerPac通用电泳仪(Bio-Rad)， GelDoc XR型凝胶成像系统(BioRad)，JB-CJ-2FX洁净工作台(苏州佳宝净化工程设备)， 电热恒温培养箱(上海福玛)，高温灭菌锅(上海博讯)，电子天平(北京Sartorius，NanoDrop 2000 超微量分光光度计(赛默飞世尔)，荧光显微镜(奥林巴斯，BX53)。

1.2方法

1.2.1重组慢病毒表达载体Plvx-WGA-IRES-Zs-Green1的构建 分别用限制性内切酶EcoRⅠ酶切目的片段模板质粒WGA-d和慢病毒载体质粒Plvx-IRES-ZsGreen1，经琼脂糖凝胶电泳分离，回收并纯化目的条带，用DNA连接酶将纯化的WGA片段与Plvx-IRES-ZsGreen1载体片段连接。连接产物转化 DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，酶切鉴定，最终测序鉴定。

1.2.2293T细胞及ADSC细胞的培养293T细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养基培养，ADSC细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养。两种细胞均在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。

1.2.3慢病毒包装将构建好的重组质粒Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1以及其他三种包装质粒RPEV、PRRE、VSVG质粒在293T细胞中进行共转染。然后放置到37℃，5%CO2恒温培养箱中培养过夜。24 h后用新鲜培养基更换细胞培养液，于37℃ 5%CO2培养箱中继续培养48 h。荧光显微镜下观察病毒包装效果。

1.2.4感染ADSC细胞转染72 h后，取共转染的293T细胞的培养液于新的离心管中。用0.45 μm的滤器过滤病毒液于无菌的干净收集管中。取出生长状态良好，汇合率70%左右ADSC细胞，弃去原培养基。向ADSC中加入原培养液体积的过滤后的病毒液。

1.2.5免疫荧光染色检测感染效果将24孔板细胞的培养液弃去，用500 μL 4%的多聚甲醛溶液固定20 min。1 mL 0.2% 吐温-20℃处理10 min。封闭液处理60 min后，加入一抗anti-WGA 500 μL，4℃，过夜。PBS洗涤3次后，加入500 μL二抗处理120 min。避光加入 DAPI (1 μg/mL)500 μL，室温下处理15 min。荧光显微镜下检测感染效果。

2结果

2.1重组慢病毒表达载体Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1的构建分别将WGA-d质粒和慢病毒载体Plvx-IRES-ZsGreen1进行酶切(图1)，1号泳道是酶切后的原WGA-d质粒，2号泳道是酶切后的Plvx-IRES-ZsGreen1载体。在1号泳道处可以看到四条条带，其中图片最下方的1 000 bp左右的是需要切胶回收的WGA片段。2号泳道共有两个条带，图片下方较亮的是没有切开的质粒，上方的是切开一个缺口的质粒，即需要胶回收的目的条带。将酶切后的目的片段WGA和慢病毒载体质粒Plvx-IRES-ZsGreen1，进行纯化、回收连接反应后。转化感受态细胞，挑选阳性克隆，最终经测序鉴定，测序结果表明Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1中的WGA序列与WGA-d质粒中的WGA序列完全一致，没有突变。

2.2慢病毒包装构建好的Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1载体是一种慢病毒表达载体，可以将插入的蛋白即WGA蛋白和ZsGreen1在ADSC细胞内进行共表达。ZsGreen1是一种绿色荧光蛋白，可以作为标记蛋白。将vx-WGA-IRES-ZsGreen1质粒、RPEV、 PRRE、 VSVG质粒在293T细胞中进行共转染，转染72 h后，荧光显微镜下发现293T细胞中含有大量带有绿色荧光蛋白的病毒颗粒(图2)，说明慢病毒包装成功。收取病毒液，感染宿主细胞ADSC，在细胞质基质中发现大量绿色荧光蛋白(图3)，推测WGA蛋白在ADSC中得到成功表达。

2.3免疫荧光染色检测WGA蛋白为了更加准确的显示ADSC细胞内WGA蛋白的表达情况，进一步利用免疫染色的方法进行检测。红色荧光代表被WGA抗体染色后的WGA蛋白表达情况(图4A)，蓝色荧光代表DAPI染色后的细胞核(图4B)，合并后发现Plvx-WGA-IRES-ZsGreen1重组载体同时表达出绿色荧光蛋白ZsGreen1和红色荧光蛋白WGA(图4C)，WGA蛋白成功在ADSC细胞中得到大量表达。

3讨论

WGA的外源性功能包括对脂肪代谢的影响、对细胞膜通透性的影响、对成纤维细胞增殖的抑制、对免疫反应的调节作用等[4，5]，WGA是研究细胞表面结构受体等的重要探针[6]。有实验采取基因工程的方法，将WGA-cDNA片段转入质粒载体中，用腺病毒包装后感染细胞，当导入的目的基因在神经元特异的启动子表达后即可通过观察WGA以达到示踪的效果[7]。实验在小鼠和果蝇上都取得了预期的效果[8]。而在一些神经退行性疾病如阿尔兹海默病、肌萎缩侧索硬化以及常见的运动神经元损伤疾病和脊髓损伤疾病的研究和治疗中，能够标记到相关的神经元进行追踪尤为重要[9，10]。

慢病毒包装WGA蛋白的方法可以作为一种高效的示踪技术广泛应用于各类细胞。特别是WGA对神经元细胞具有特异性，又能够跨突触传递，这使得运用慢病毒包装WGA来进行神经元示踪具有特别的优越性[11]。一方面可以进行原位注射病毒的办法追踪神经元的生长和迁移，另一方面，WGA的神经元特异性和顺行逆行的特性可用于追踪和标记功能和结构相关的神经通路[12，13]。这都使得关于神经系统的研究更为准确、快捷。此外，采用慢病毒包装WGA进行干细胞的体内分化示踪研究也具有一定优势。

本实验通过现代基因工程的方法将WGA蛋白的序列成功的插入到慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1中。成功的构建了WGA的慢病毒表达载体。并将该表达载体和其他三种包装质粒(RPEV、PRRE、VSVG)通过与293T细胞进行共转染，包装成病毒颗粒。收取病毒液后，用其感染ADSC，显微镜下检测感染成功后，再用免疫荧光染色技术，将WGA蛋白染色观察。结果显示，WGA蛋白在ADSC中实现了高效表达并成功染色。为下一步运用ADSCs进行细胞疗法，观察其对脊髓损伤的治疗效果，为ADSCs分化治疗提供显色追踪提供基础。

参考文献

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Study on the construction and expression of lentivirus-wheat germ agglutinin expressing vector

WANG Juan1ZHANG Lianguo2MA Yun3BIAN Weihua4

1 Department of cell engineering, School of Pharmaceutical Sciences, Binzhou Medical University, Yantai 264003, P.R.China;2 Department of Thoracic Surgery, Binzhou Medical University Hospital; 3 Department of Central Laboratory, Binzhou Medical University Hospital; 4 Department of Cell biology, School of Pharmaceutical Sciences, Binzhou Medical University

【Abstract】ObjectiveTo investigate the construction and expression of wheat germ agglutinin lentivirus expression vector.MethodsBy using genetic engineering methods,The WGA gene were inserted into a lentivirus expression vector Plvx IRES-ZsGreen1.Then the recombinant plasmid and three other kinds of packaging plasmid (RPEV,PRRE and VSVG) were used to co-transfect with 293T cells till getting the virus and then infected the human adipose tissue-derived stem cells (ADSCS).After that, we dyed the ADSC by using immunofluorescence technique.ResultsThe results showed that the WGA protein was expressed successfully in adipose stem cells.ConclusionsThe method of packaging WGA protein in lentivirus is reliable and efficient, which could be used for the next step of tracer experiment.

【Keywords】Wheat germ agglutinin,lentivirus vector,immunofluorescence technique,adipose tissue-derived stem cells

(收稿日期：2015-11-14)

【中图分类号】Q812

【文献标志码】A

【文章编号】1001-9510(2016)02-0092-04

通讯作者：卞伟华,E-mail：492752507@qq.com

基金项目：国家自然科学基金(31401258)；山东省自然科学基金(ZR2012BM006)