绵羊GDF9基因研究进展

徐敏丽 白莉雅 王建英 崔绪奎 张果平

摘 要：开展绵羊多羔性状主效基因的研究，对于揭示绵羊高繁殖力的分子机制和利用分子标记辅助选择迅速提高绵羊的繁殖性能有重要意义。GDF9属于TGFβ超家族成员，它主要由卵母细胞分泌，对卵泡的生长和分化、卵母细胞的减数分裂、成熟和胚胎的发育起重要的调节作用。因此，可以将GDF9基因作为绵羊繁殖性状的候选基因来研究。本文就GDF9基因、蛋白结构及其表达、生物学作用以及对绵羊繁殖力的影响等方面的研究进行总结回顾，并对其应用前景进行展望。

关键词：绵羊；多羔；GDF9

中图分类号：S826：Q754文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）05-0148-06

Abstract To reveal the molecular mechanism of high sheep fecundity and improve sheep reproduction performance by marker-assisted selection， it is necessary to carry out the researches on major genes affecting sheep fecundity. As a member of TGFβ super family， GDF9 is secreted by oocyte， and plays an important role in the growth and differentiation of follicle， meiosis and maturation of oocyte， as well as embryo development. Thus GDF9 gene is considered as the candidate gene of sheep fecundity. The researches on gene structure， protein structure， expression， biological function and effects on sheep fecundity of GDF9 were summarized in this article， then its application prospect was anticipated.

Key words Sheep； Fecundity； GDF9

绵羊的繁殖性状与经济效益密切相关，繁殖力的高低直接影响生产成本。绵羊产羔数性状遗传力很低，只有0.1左右，如果仅靠简单的杂交育种和自然选择，每个世代仅可提高约2%的产羔数，效率很低。另外羔羊生长速度与窝产仔数有关，加上几乎所有动物的繁殖性状与生长速度呈负相关关系，因而影响应用常规育种方法进行选择的效果和可操作性。分子标记辅助选择（Marker-assisted selection， MAS）能够通过影响选择时间、选择强度以及准确性而极大地提高这类低遗传力性状的选择功效，而找到影响产羔数的主效基因或与其连锁的分子遗传标记是实现分子标记辅助选择的先决条件。开展绵羊多羔性状主效基因的研究，不仅可以从遗传上阐明绵羊高繁殖力的分子机制，为通过分子标记辅助选择全面提高绵羊的繁殖性能提供可能，而且可以通过基因聚合、转基因等手段为多胎绵羊品种培育提供遗传材料，这对我国乃至全世界养羊业将具有十分重要的理论意义。

生长分化因子9（Growth differentiation factor 9， GDF9）基因是公认的绵羊多羔性状主效基因之一，它的研究工作对于揭示绵羊繁殖机理和利用分子标记辅助选择提高羊群的繁殖性能和生产效益有着重要意义。GDF9属于转化生长因子β （Transforming growth factor beta，TGFβ） 超家族成员，它是由卵母细胞分泌的一种生长因子，通过旁分泌方式对卵泡的生长和分化起重要调节作用[1]。GDF9基因表达水平和多态性与绵羊的繁殖力密切相关。本文就GDF9基因、蛋白结构及其表达、作用通路、生理功能、基因表达水平和多态性对绵羊繁殖力的影响等方面的研究进行总结回顾，并对其应用前景进行展望。

1 GDF9基因、蛋白结构及表达

绵羊GDF9基因位于5号染色体上，CDS全长约2.5 kb，可编码453个氨基酸。外显子1长397 bp，外显子2长965 bp，两个外显子由长1 125 bp的内含子分隔开。不同物种间GDF9基因结构非常相似，均含有2个外显子和1个内含子，其同源性也较高，绵羊与人、小鼠的GDF9氨基酸序列一致性分别为77%和66%[2]，这为研究不同物种GDF9基因提供了有利条件。

GDF9主要在卵巢的卵母细胞中表达，其在人类和各种动物体内表达的时间与定位有所不同，可能与物种间差异有关，如绵羊、牛、负鼠、仓鼠GDF9表达始于原始卵泡阶段，而小鼠、大鼠和人GDF9表达始于初级卵泡阶段[3]。除原始卵泡阶段，GDF9的表达贯穿于绵羊卵泡发育的始终，直至排卵后仍有表达，其表达时间和方式与其参与卵泡形成的启动和维持功能是吻合的[2]，除卵母细胞外，GDF9在哺乳动物卵巢[4]、睾丸[5～7]、垂体、子宫和骨髓[4]中亦有表达。

GDF9蛋白结构不同于大多数TGFβ超家族生长因子，它的羧基末端（C-末端）只有6个半胱氨酸（Cys），而不是TGFβ超家族保守的7或9个Cys，其中位于C-末端参与成熟蛋白二硫键形成的Cys被丝氨酸（Ser）替换，这表明GDF9单体可能是由非共价健连接形成的二聚体[8]。

2 GDF9的作用通路及生理功能

和TGFβ超家族其它成员一样，GDF9也能通过与单次跨膜的丝/苏氨酸激酶活性受体Ⅰ（Activin receptor-like kinase 5， ALK5） 、受体Ⅱ（BMP type Ⅱ receptor ， BMPRⅡ）结合激活经典的Smad2/3信号通路来实施生物学应答。此外，GDF9还能以不依赖Smads的方式参与细胞功能的调节[9]。

在卵泡发育过程中，除了下丘脑-垂体-性腺轴间的内分泌调节外，GDF9在调节卵泡的生长分化[10，11]、促进颗粒细胞增殖、抑制颗粒细胞[12，13]和卵泡膜细胞[14]分化、诱导卵丘扩展[15]、影响卵巢类固醇激素[13，16，17]、蛋白酶和细胞因子[15]的合成、维持稳定的发育卵泡内微环境中起着不可或缺的作用。敲除GDF9的小鼠由于卵泡生成的初级卵泡阶段受阻从而导致雌性不育[16]，在大鼠体内给予GDF9能促进原始卵泡和初级卵泡发育成小窦卵泡[10]。

GDF9还参与绵羊卵母细胞的减数分裂、成熟和胚胎发育的调控。研究发现，GDF9基因转录从母羊妊娠后56天开始出现，94天达最高水平，后逐渐降低。而56～75天胎龄时，卵原细胞开始进入第一次减数分裂前期的细线期或偶线期，成为初级卵母细胞[18]。在绵羊卵母细胞的发育过程中，GDF9最高表达量出现在GV期卵母细胞，在随后的MⅡ期卵母细胞、2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、桑椹胚中表达量逐步下降，囊胚中检测不到其表达[19]。

卵泡的发育和卵母细胞的逐步成熟是同步的。GDF9可通过调节卵泡的发育、卵丘扩张中关键酶的活性和颗粒细胞形态、数量、排列的变化影响卵母细胞的生长发育和成熟[15]。GDF9缺失可使卵泡中颗粒细胞Kit配体和抑制素-α的表达上调，间接影响小鼠卵母细胞的生长和成熟[14]。添加GDF9能够提高牛[17]和猪[20]的卵母细胞成熟率。

此外，GDF9还能提高绵羊[21]、牛[17]、猪[20]和小鼠[22]等的胚胎质量和发育能力。重组的人GDF9能够提高牛的卵母细胞成熟率、卵裂率和克隆胚胎的囊胚形成率[17]。在猪卵母细胞体外成熟培养过程中，添加GDF9能显著提高其囊胚形成率[20]。在促卵泡素（Follicle- stimulating hormone，FSH）和表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）存在下，外源的GDF9能显著提高小鼠卵母细胞的囊胚形成率和内细胞团（Inner cell mass，ICM）细胞数量，15天的成活胚胎数亦有所提高[22]。

GDF9基因与FSH、骨形态形成蛋白（Bone morphogenetic protein， BMP15）等激素或生长因子在动物卵泡发育中起着协同效应。在未分化的颗粒细胞中，GDF9可降低FSH的生物学效应，调节颗粒细胞的生长，抑制颗粒细胞过早黄素化[12]。GDF9通过一种内在的前列腺素E2配基受体信号途径来改变排卵前被FSH/LH激活的颗粒细胞的分化状态，促进颗粒细胞合成孕酮[23]。GDF9和BMP15发挥的功能因物种而异，它们一起发挥的作用与独自所起的作用不尽相同[24]。Sugiura等[25]认为BMP15对GDF9发挥作用起放大效应。

除卵母细胞外，GDF9在其它性腺组织和非性腺组织中的表达暗示其可能具有更广泛的生物学效应。随着研究的不断深入，更多GDF9的新功能将被揭示出来，这将为我们合理有效地利用它服务于生产提供很大的便利。

3 GDF9基因对绵羊繁殖力的影响

3.1 GDF9基因表达水平对绵羊繁殖力的影响

绵羊的排卵率对GDF9的剂量变化很敏感[26]。Crawford 等[27]认为裸卵（Denuded oocytes， DO）中GDF9与BMP15基因表达水平的比值可能可以解释物种间繁殖率的差异。研究发现，高产的湖羊群体中窦状卵泡的GDF9基因表达量显著高于低产的湖羊群体[28]，至于何种因子引起GDF9表达变化进而影响湖羊的繁殖力尚不清楚。

3.2 GDF9基因多态性对绵羊繁殖力的影响

对绵羊GDF9基因多态性的研究较多，已检测到的突变有15个（表1），有8个突变位点影响一些绵羊品种的排卵率或产羔数，其中有3个突变位点（Fec GH、Fec TT、Fec GV）的突变杂合子排卵率高于野生型，而突变纯合子是不育的。这可能是通过影响GDF9成熟蛋白的形成[29]、GDF9形成二聚体的能力[30]以及GDF9与ALK5[31，32]、BMPRⅡ[33]的结合来实现的。

在有的绵羊品种中，GDF9多态性与其它多羔性状基因多态性同时存在，已发现Belclare/Cambridge、Lacaune、小尾寒羊和Garole四个绵羊品种都同时存在多羔性状基因BMPRIB 和GDF9的多态性[34]。

4 GDF9基因在绵羊业上的应用前景

4.1 超排药物的替代品

为充分发挥优良母羊的繁殖潜力，畜牧生产上常进行超数排卵处理。对促性腺激素不依赖阶段的卵泡进行超排是影响超排效果好坏的关键。随着对GDF9和BMP15作用机理的认识和体外重组技术的成熟，可从临床上对两个发育阶段的卵泡进行人为干预，减少促性腺激素的用量，使促排卵方案更加合理[50]。

4.2 在绵羊育种中的应用和注意事项

对影响绵羊繁殖力的GDF9基因突变进行分子标记辅助选择，或人为导入GDF9突变均可提高绵羊排卵率和产羔数。但由于有不少BMP15或GDF9突变纯合子是不育的，所以在利用这些突变时需要对育种计划进行仔细设计[51]。

在利用杂合子优势积累高产基因型提高母羊繁殖力时，对群体的突变基因频率需加以适度控制，突变基因的平衡效率在0.11和0.23之间是已报道的最高的多态性[52]。

在养羊生产上，利用杂合子优势进行留种时，为防止遗传漂变，群体不要过小，否则会改变等位基因频率，引起近交衰退[53]。

多胎性状具有加性效应，不同多胎主效基因间互作可有增强效应。利用基因聚合育种手段同时将多个多羔性状主效基因集中在一个品种上，其生产水平就越高，对于人类社会的贡献就越大。所以在利用GDF9提高绵羊繁殖能力时，可考虑同时利用或导入其它多羔性状主效基因。

杂合子优势的发挥还依赖于环境条件，在恶劣的环境条件下，这种优势体现不出来。所以在养羊生产中，为充分发挥其优势，需进行良好的饲养管理。另外杂合子的选择系数与生产水平有关，在集约化生产中杂合子的选择系数为0.068，而在恶劣条件下，野生型选择系数为0.008左右[52]。

4.3 未来研究方向

多羔主效基因的发现为人们研究畜禽的遗传育种工作提供了新的思路，引起了国内外科研工作者的研究热情，绵羊GDF9基因的研究工作取得了不少进展。外源性生长因子的应用和高产GDF9基因型的定向诱导，可人为干预绵羊的繁殖力，对畜牧业的增产大有裨益，但是还有很多机制尚需进一步阐明。如GDF9通过Ser/Thr激酶受体激活Smad2/3信号通路来调控靶基因的表达，但是什么信号调控GDF9的表达尚不明确；不同绵羊品种高繁殖力性状与GDF9基因的不同突变密切相关，这些突变是否引起蛋白空间构象变化，它们是否以及如何影响蛋白质的翻译后修饰过程尚不明了；以及GDF9与BMP15如何发挥协同作用产生加性效应的尚不可知。今后应针对这些问题展开进一步的研究。

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