响应面法优化生防枯草芽孢杆菌B579固相发酵工艺

孙冰冰 杨秀荣 郝永娟 李伟 魏军 田涛

摘 要：为提高生防芽孢杆菌的发酵水平，利用响应面法对生防枯草芽孢杆菌B579进行固相发酵条件优化，以建立一套适合生防芽孢杆菌的固相发酵技术体系。首先通过Plackett-Burman试验筛选出对发酵产量影响显著的重要因素，然后进行最陡爬坡试验逼近最大菌体产量值区域，通过Box-Behnken和响应面试验设计，得到回归模型，并对回归模型进行回归分析和实践验证。结果表明：对发酵产量影响显著的3个重要因素为牛肉膏、玉米粉和可溶性淀粉，当其浓度分别为15.1、10.3 g/kg和9.14 g/kg时，发酵水平达到最高，为1.93×10¹¹cfu/g，比液相发酵水平提高了15倍；经验证该模型准确可靠。

关键词：生防芽孢杆菌；固相发酵；响应面法

中图分类号：S482.2+92文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）05-0062-05

Abstract To enhance the fermentation level of biocontrol Bacillus， the solid-state fermentation conditions of Bacillus subtilis B579 were optimized using response surface methodology to establish the related technology system. Firstly， the Plackett-Burman experiment was applied to screen the importan influential factors， and then the path of steepest ascent was used to approach the biggest region of the cell yield. Moreover， the Box-Benhnken experimental design and response surface methodology were employed to get the regression model， which was proved through regression analysis and practice verification. The results showed that the three factors affecting fermentation production were beef extract， corn meal and soluble starch. The fermentation production reached the highest as 1.93×10¹¹cfu/g， when the content of beef extract， corn meal and soluble starch were 15.1， 10.3 and 9.14 g/kg respectively. Under the optimized fermentation conditions， the solid fermentation production of biocontrol Bacillus increased by 15 times compared to the liquid fermentation. The regression model was verified to be accurate and reliable.

Key words Biocontrol Bacillus； Solid-state fermentation； Response surface methodology

一直以来，化学农药及肥料的使用对于植物病虫害防治和提高农作物产量品质起到重要作用，但大量有害化合物的使用造成了土壤和地下水的严重污染，对生物及人类的生存也造成了严重危害。在过去的几十年中，世界各国都在努力开发可替代传统化学药剂控制植物病虫害的新方法，利用微生物及其代谢产物进行生物防治，被公认为是一种环境友好型的选择。微生物生防菌剂的研究与开发已成为生物防治的一个重要内容。芽孢杆菌是土壤和植物微生态区系的优势生物种群，许多性状优良的菌株表现出对多种植物病原菌的拮抗作用[1～3]。生防芽孢杆菌目前已在水稻、玉米、小麦、大豆、辣椒、棉花、番茄等农作物上显示出较好的病害防治效果[4]。芽孢杆菌被认为是最有希望的微生物菌剂候选菌群，并且进行了广泛研究[5～7]。市场上的生防芽孢杆菌制剂多采用液相深层发酵技术。液相深层发酵投资大、成本高、技术要求高、产生废液多、污染严重[8，9]。而固相发酵整个发酵过程与微生物在自然环境中所发生的微生物反应相似，可以利用工农业生产中的副产品进行发酵[10]，避免了液相发酵原材料价格较高的不足，从而降低了生产成本，此外发酵过程能耗低，没有废物排放，且适宜工业化生产，日益受到人们重视。

本研究以降低生产成本、促进生防菌剂的推广使用、减少化学农药使用为目的，以生防芽孢杆菌为供试菌株，利用农产品加工过程中的副产物菇渣（廉价且易获得）、麦麸、豆渣作为固体发酵基质，采用响应面法优化生防芽孢杆菌的固相发酵工艺，提高发酵水平，以建立一套适合生防芽孢杆菌的固体发酵技术体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 生防枯草芽孢杆菌B579，由天津市植物保护研究所粮经病害研究室提供。生防芽孢杆菌TB1301、TB1336、TB1340、TB1363，由天津市植物保护研究所植病生防研究室从土壤中分离得到，对土传病害（辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、瓜果腐霉菌Pythium aphanidermatum）有很好的拮抗作用。经16S rRNA分子鉴定，TB1340菌株初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌[11]，TB1301、TB1336和TB1363菌株的鉴定工作正在进行。

1.1.2 培养基 斜面培养基（LB培养基）：蛋白胨10.00 g/L，酵母膏浸粉5.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，琼脂粉 20 g/L，pH调至6.8～7.2，121℃灭菌30 min；液体种子培养基：蛋白胨 10.00 g/L，酵母膏浸粉5.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，pH调至6.8～7.2，121℃灭菌30 min；固相发酵培养基的配制：称取一定量蘑菇残渣（为主）、麦麸、大豆残渣及其他影响因素（具体参数参见表1），pH调至6.8～7.2，加入一定量水至没有流动水相，121℃灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 菌体增殖方法 刮取LB培养基平板上培养24 h的生防芽孢杆菌B579接种到30 mL液体LB培养基中，于温度为37℃、摇床转速为160 r/min条件下培养12～16 h，作为种子液备用。然后以3%～5%的接种量接种到固相发酵培养基中，于37℃静置培养72 h，每24 h摇晃一次。

1.2.2 Plackett-Burman试验设计 Plackett-Burman试验设计是一种两水平的试验设计方法，可以用最少试验次数估计出主效应因素，适用于从众多的试验因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素。根据芽孢杆菌生长所需要的营养条件，通过查阅文献及前期试验，选取10个影响因素，每个影响因素取高（+）、低（-）两个水平，以菌体产量（Y）为响应值，采用中心点为3、N=15的Plackett-Burman试验设计。各参数及其水平见表1。

1.2.3 最陡爬坡试验设计（steepest ascent design） 最陡爬坡试验以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值大小确定变化步长，能快速经济地逼近最佳值区域。根据Plackett-Burman试验结果各显著影响因素效应的大小设定步长及变化方向，正效应因素取较高值，负效应因素取较低值。

1.2.4 Box-Behnken试验设计 本试验确定出3个关键因素对响应值有重要影响，每个因素取3个水平，以（-1，0，1）编码，根据相应的实验表进行试验后，对数据进行二次回归拟合，得到包括一次项、平方项和交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定水平范围内求取最佳值。经回归拟合，各试验因子对响应值的影响可以用下列函数表示：

1.2.5 回归模型拟合优化的验证 通过响应面优化方法得到的最优固相发酵条件，对生防芽孢杆菌B579以及本实验室由蔬菜根际土壤分离的对土传病害具有较好拮抗作用的芽孢杆菌TB1301、TB1336、TB1340、TB1363进行回归模型可靠性验证。每个试验重复3次，对应的响应值取平均值。

1.2.6 生防芽孢杆菌固相发酵水平测定 生防芽孢杆菌固相发酵水平以其菌体量来测定，采用细菌菌落总数测定法[12]。

1.3 数据分析

采用软件Design-expert.v 8.0.6进行试验设计及结果分析。

2 结果与分析

2.1 影响芽孢杆菌固相发酵水平的重要因素筛选

Plackett-Burman试验设计表及试验结果见表2。Plackett-Burman试验各因素参数分析见表3。从表3的概率值（P<0.0001）大小可以看出，对枯草芽孢杆菌固相发酵水平具有显著影响的因素是牛肉膏（X1）、玉米粉（X4）和可溶性淀粉（X6），可作为主要因素考虑进一步做响应面试验。其中牛肉膏（X1）为负效应因子，在进一步的最陡爬坡试验中取其较小值，玉米粉（X4）和可溶性淀粉（X6）为正效应因子，因此在最陡爬坡试验中均取其较大值。

2.2 最陡爬坡试验设计及其结果

表4中列出了显著影响因子的变化方向、步长及其试验结果。结果表明：菌体产量在0～0+4△之间先明显上升后开始下降，当牛肉膏为15.5 g/kg、玉米粉为10.0 g/kg、可溶性淀粉为9.1 g/kg时固相发酵水平达到最大，为三因素的最大响应值区域，故以此条件为进一步响应面试验中心点。

2.3 Box-Behnken试验设计及结果

根据最陡爬坡试验设计结果确定3个重要因子的最佳浓度范围后，以牛肉膏为15.5 g/kg、玉米粉为10.0 g/kg、可溶性淀粉为9.1 g/kg为试验中心点进行响应面分析。Box-Behnken试验设计因子编码水平见表5，试验设计及结果见表6。

利用软件Design-expert.v 8.0.6对Box-Behnken试验结果进行二次多项式回归拟合，得到生防芽孢杆菌固相发酵水平对牛肉膏、玉米粉及可溶性淀粉的二次多项式回归方程：

拟合回归方程的决定系数R2=0.9823，说明该回归模型可以解释98.23%的试验所得的B579固相发酵水平，表明回归方程拟合良好，可用于预测生防芽孢杆菌固相发酵水平的实际情况。

由回归方程系数显著性检验（P<0.05，见表7）得知，模型项X1、X4、X6、X4X6、X42、X62对回归模型影响显著。

图1、图2和图3绘制了回归方程的三维响应面分析图及对应的等高线图，每个响应面分别代表两个独立影响因子间的相互作用，而此时第三个因子保持在编码0的水平。从响应面图可以看出：在固相发酵试验中，牛肉膏、玉米粉和可溶性淀粉的添加浓度和发酵水平存在显著相关性，同时可以发现两两影响因子之间存在一定相互作用，对发酵水平的影响不是直观的线性关系。根据回归方程在各影响因子取值范围内求解最优值得出，在X1、X4 和X6的值分别为15.1、10.3 g/kg和9.14 g/kg时，发酵水平达到最高，为1.93×10¹¹cfu/g。

2.4 响应面模型验证

根据回归方程得出的固相发酵水平的极值点进行模型验证，在优化的培养条件下对本实验室自有菌株TB1301、TB1336、TB1340、TB1363进行固相发酵小试，所得发酵产量分别为1.94×10¹¹、1.92×10¹¹、1.93×10¹¹、1.93 ×10¹¹cfu/g。经响应面法优化的发酵条件下的固相发酵水平与建立的响应面模型的预测值1.93×10¹¹cfu/g相接近，证明响应面法优化生防芽孢杆菌的固相发酵条件可行，所建立的回归方程可靠。

3 结论与讨论

相比传统的液相深层发酵方法，固相发酵技术在生防芽孢杆菌研究中的应用越来越多。本试验通过响应面分析法对生防芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件进行优化，并对结果进行统计学上的回归模拟和预测，经济、准确、高效地得到最优发酵条件。研究结果表明，牛肉膏、玉米粉和可溶性淀粉的浓度分别为15.1、10.3 g/kg和9.14 g/kg时，生防芽孢杆菌固相发酵水平达到最高，为1.93×10¹¹cfu/g。相比枯草芽孢杆菌B579液相发酵水平1.23×10¹⁰cfu/mL提高了15倍[13]。经过本实验室自有菌株TB1301、TB1336、TB1340、TB1363固相发酵小试充分验证了回归模型的可靠性、准确性，不仅说明了利用响应面法优化生防芽孢杆菌固相发酵工艺可行，而且其所建立的固相发酵技术体系对生防芽孢杆菌具有普遍适用性。生防芽孢杆菌固相发酵条件的优化，为生防菌的中试发酵生产与示范提供了技术支持，有效推动了生防菌剂的开发和应用。

参 考 文 献：

[1] Asaka O， Shoda M. Biocontrol of Rhizoctonia solani damping off of tomato with Bacillus subtilis RB14[J].Applied and Environmental Microbiology， 1996，62（11）：4081-4085.

[2] 陈志谊，高太东，严大富，等.枯草芽孢杆菌B-916防治水稻纹枯病的田间试验[J].中国生物防治，1997，13（2）：75-78.

[3] 程亮，游春平，肖爱萍.拮抗细菌的研究进展[J].江西农业大学学报，2003，25（5）：732-737.

[4] 周晓梅，刘强，王瑛璐.拮抗菌生物防治农作物病害的研究进展[J].吉林师范大学学报，2010，36（1）：36-39.

[5] 陈中义，张杰，黄大昉.植物病害生防芽孢杆菌抗菌机制与遗传改良研究[J].植物病理学报，2003，33（2）：97-103.

[6] 陈志谊，刘永锋，陆凡.水稻纹枯病生防菌Bs-916产业化生产关键技术[J].植物保护学报，2004（4）：230-234.

[7] Emmert E A B， Handelaman J. Biocontrol of plant disease： a （Gram-） positive perspective[J]. FEMS Microbiol Letters，1999，171：1-9.

[8] 李晶，杨谦.生防枯草芽孢杆菌的研究进展[J].安徽农业科学，2008，36（1）：106-111.

[9] 俞俊棠.新编生物工艺学[M].北京：化学工业出版社，2003.

[10]徐福建，陈洪章，李佐虎.固态发酵工程研究进展[J].生物工程进展，2002，22（1）：44-48.

[11]孙冰冰，段红英，李伟，等.辣椒疫霉菌拮抗细菌的筛选、鉴定及防效测定[J].山东科学，2014，27（3）：23-29.

[12]杜连祥，路福平.微生物学实验技术[M].北京：中国轻工业出版社，2006：68-73.

[13]王雪莲，王敏，骆健美，等.枯草芽孢杆菌生防菌B579最佳培养基响应面法优化[J].江苏农业学报，2009，25（1）：212-215.