基于ITS序列探讨空心瓜在葫芦科中的系统分类

江彪 刘文睿 何晓明 彭庆务 林毓娥 梁肇均 谢大森

摘 要 空心瓜是葫芦科一年生草本植物，是葫芦科重要的抗性资源。然而，长期以来其系统分类不清，严重影响空心瓜的利用。空心瓜形态学观察结果发现，与冬瓜具有许多相似之处。随后克隆其ITS序列，并与葫芦科其他作物进行系统进化分析，结果发现，空心瓜与冬瓜的遗传距离仅为0.03，位于进化树同一个分支末端，这表明空心瓜归属于冬瓜属。本研究不仅为空心瓜的系统分类提供直接的分子证据，而且为利用空心瓜拓宽冬瓜种质资源奠定重要的研究基础。

关键词 空心瓜 ；葫芦科 ；ITS ；系统分类

中图分类号 Q949.782 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.06.012

The Taxonomic Classification of Praecitrullus fistulosus in Cucurbitaceae

based on Internal Transcribed Spacer Sequences

JIANG Biao LIU Wenrui HE Xiaoming

PENG Qingwu LIN Yu'e LIANG Zhaojun XIE Dasen

（Vegetable Research Institute， GAAS / Guangdong Provincial Key Lab for New Technology

Research on Vegetables， Guangzhou， Guangdong 510640）

Abstract Praecitrullus fistulosus is an annual Cucurbitaceae herb and it is an important resistant source in Cucurbitaceae. However， the systematic classification of P. fistulosus is unclear for a long time， which seriously affects its utility. Based on the morphological observation， author finds that there are many similarities between P. fistulosus and Benincasa hispida. Subsequently， this paper carries out phylogenetic analysis with other Cucurbitaceae species by clone the ITS sequence. The result showed that the genetic distance between P. fistulosus and B. hispida is only 0.03， and they locates in the same terminal branch of the phylogenetic tree. This indicates that P. fistulosus belongs to Benincasa. This study not only provides a more clear evidence for the classification of P. fistulosus， but also lays an important foundation for the utility of B. fistulosus to broaden B. hispida germplasm.

Keywords Praecitrullus fistulosus ； cucurbitaceae ； ITS ； phylogenetic classification

空心瓜[Praecitrullus fistulosus（Stocks）Pangalo，2n=2x=24]是葫芦科一年生草本植物，起源于印度西北部，目前在印度、巴基斯坦等地广泛种植。在印度，空心瓜被称为“tinda”，以幼嫩果实为食用器官，也被称为印度圆葫芦（Indian Round Gourd）、苹果葫芦（Apple Gourd）和印度宝贝南瓜（Indian Baby Pumpkin）[1]。前人研究结果表明，空心瓜可能对白粉虱具有一定的抗性[2]。Levi等[3]的研究结果显示，空心瓜在苗期抗枯萎病。因此，空心瓜可能是一个优良抗性资源，对于葫芦科作物育种具有重要的应用潜力。

空心瓜在葫芦科的系统分类是一个复杂的认知过程。由于空心瓜的花、种子和叶等许多形态学特征均与西瓜相似，因此，Sujatha等[1]认为空心瓜是西瓜的一个近缘野生种，并将其命名为Citrullus vulgaris var. fistulosus（tinda）。此外，基于同工酶研究结果，Navot等[4]研究发现，空心瓜与所有西瓜属植物均不同，因此认为，空心瓜不应该归于西瓜属。另一方面，也有报道认为，空心瓜应归为甜瓜属，因为其染色体基数与甜瓜相同[5-6]。然而空心瓜与甜瓜杂交不亲和，并且同工酶分析结果表明，空心瓜与西瓜、甜瓜均不相同[1]，因此空心瓜不应归于西瓜属或甜瓜属。此外，Levi等[7]利用RAPD标记和ISSR标记研究空心瓜与甜瓜属、西瓜属的亲缘关系，结果表明，空心瓜与甜瓜属、西瓜属间的遗传距离较远。

近年来，空心瓜在葫芦科作物中的系统分类有了新的发现[3，8-9]。Schaefer等[8]利用叶绿体多基因序列对葫芦科114个属的25%植物进行了进化分析，结果显示，空心瓜与冬瓜（Benincasa hispida）位于系统发育树的同一个末枝，表明空心瓜与冬瓜具有较高的遗传相似性。Levi等[3]利用分子标记研究空心瓜与西瓜、甜瓜、冬瓜、葫芦、南瓜等作物的亲缘关系，结果表明，空心瓜与冬瓜的亲缘关系最近，同时通过花粉粒形态观察，结果发现，空心瓜与冬瓜的花粉粒相似，均为球形或半球形，说明空心瓜很可能是冬瓜属植物。

核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacers， ITS）是研究植物分类和亲缘关系的重要工具[10-15]。因此，本研究通过克隆空心瓜的ITS序列，并与葫芦科其他作物进行系统进化分析，从而探讨空心瓜在葫芦科作物中的分类地位。

1 材料与方法

1.1 材料

空心瓜种子由郑州果树研究所王吉明研究员馈赠，种植于广东省农业科学院蔬菜研究所白云试验基地。同时对空心瓜的形态学性状进行调查统计，包括叶、茎、雌雄花、果实、种子等。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取刚展开的幼嫩叶片，采用CTAB法提取基因组DNA[16]。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度及质量，并将其稀释至50 ng/μL，置于-20℃冰箱中备用。

1.2.2 ITS序列扩增

ITS序列包括ITS1、5.8 S rDNA和ITS2，采用双引物扩增。两侧引物分别为：ITSR 5′-CCTTATCATTAGAGGAAGGAG-3′[17]，ITSF 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[18]。PCR反应总体积为20 μL，包含基因组DNA 20 ng、正反向引物50 ng、dNTPs 2.5 mmol/L、MgCl2 2.5 mmol/L、10×PCR buffer和Taq DNA聚合酶1 U（TaKaRa）。PCR扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。

1.2.3 PCR产物的克隆

PCR产物利用1%琼脂糖凝胶进行检测，并用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（康为世纪）回收目的产物。回收产物经纯化后连接于pMD19-T载体（TaKaRa），并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培育后，进行蓝白斑筛选，挑取白色单克隆，在含有100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜。最后以菌液为模板进行PCR扩增，并将阳性克隆送往上海英俊生物技术有限公司测序。

1.2.4 序列分析

去除载体序列后，将空心瓜ITS序列与葫芦科其他作物的ITS序列进行分析（表1）。基于已公布的序列信息[19]，确定各个ITS序列的ITS1、5.8 S和ITS2区。所有序列采用Cluster W进行多序列比对[20]，并利用Bio XM 2.6进行GC含量分析。同时，利用MEGA 5.05软件以Kimura-2模型分析序列间的遗传距离。进一步以秋海棠的ITS序列（AF485089）作为外根群，利用MEGA 5.05软件以邻接法（Neighbor-joining）和最大简约法（Maximum parsimony）构建系统进化树，以自展法（bootstrap）进行检测，共循环1 000次[21]。

2 结果与分析

2.1 空心瓜的形态学观察

空心瓜为一年生蔓生植物，茎被硬毛及长茸毛，有棱沟。叶片肾形，具深裂，边缘有小齿。叶柄粗壮，被粗硬毛和长茸毛。雌雄同株异花，雄花具花瓣5～6枚，被长茸毛，雄蕊3个；雌花具花瓣5～6枚，近球形，被较密的长茸毛，分柱头3个。成熟果实较小，近球形，被稀刚毛，果肉白色。种子为有棱双边，黑色，呈卵形，两面平滑（图1）。

2.2 空心瓜ITS序列克隆

以空心瓜基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得一条约720 bp的目的片段（图2）。目的片段通过回收测序、去除18S及26S序列后，获得总长度为614 bp的ITS1+5.8S+ITS2序列。该序列已提交到GenBank中，登录号为KU358563。进一步将其与其他55种葫芦科作物的ITS序列（表1）进行综合比较。从表1中可看出，所有材料的ITS序列长度变异较大，变化范围为591～679 bp。葫芦科作物的5.8S rRNA较为保守，长度均为163 bp，GC含量变化范围为57.67%～59.51%（表2）。而ITS1和ITS2变异较大，其中ITS1的长度介于179～240 bp，GC含量变化范围为50.00%～72.28%；ITS2的长度为227～279 bp，GC含量变化范围为54.51%～70.76%（表2）。

序列经Cluster W比对后，在259个ITS1位点中，变异位点共有196个，其中信息位点173个，占总位点的88.27%。332个ITS2位点中，变异位点有244个，其中信息位点有180个，占总位点数的54.22%。5.8S rRNA较为保守，在163个位点中，仅有16个变异位点，其中只有2个是信息位点。

2.3 葫芦科作物ITS序列的遗传距离及系统进化分析

利用Kimura-2模型，以MEGA 5.05软件分析ITS序列间的遗传距离。所有葫芦科作物ITS之间的遗传距离变化范围为0.01～0.36，其中Cucumella aspera（Cucumella属）与Oreosyce africana（Oreosyce属）之间的遗传距离最小，仅为0.01，而Bolbostemma paniculatum（假贝母属）与Gomphogyne cissiformis（锥形果属），以及Cucurbita pepo（南瓜属）与Gomphogyne cissiformis（锥形果属）间的遗传距离最大，达到0.36。将空心瓜的ITS序列与所有其他作物的ITS相比较，其遗传距离变化范围为0.03～0.30，其中与Benincasa hispida冬瓜（冬瓜属）的遗传距离最近（0.03），这表明与其他葫芦科作物相比，空心瓜与冬瓜具有更近的亲缘关系。

为确定空心瓜在葫芦科中的分类地位，以葫芦科作物的ITS序列为材料，利用秋海棠作为外根群构建系统进化树。所有序列经Cluster W比对后，共有775个位点，其中369个为信息位点。分别采用邻接法和最大简约法构建系统进化树，2种方法均得到基本相似的结果。图3是邻接法构建的系统进化树，从图3中可看出，这56份葫芦科作物可分为11个亚族，其中空心瓜与冬瓜均属于Benincaseae（冬瓜）亚族，且位于同一个分支末端，远离其他葫芦科作物。

3 讨论与结论

为了探讨空心瓜在葫芦科中的系统分类，多年来分类专家先后根据形态学及分子标记等手段开展了许多工作[1，3-8]。由于其形态特征与西瓜相似，而染色体基数与甜瓜相同，因此，人们误认为空心瓜归属于西瓜属或甜瓜属，并期望通过杂交来拓宽西瓜或甜瓜的遗传基础[1，5]。近年来，Schaefer等[8]和Levi等[3]先后通过叶绿体多基因序列及分子标记和花粉粒形态学观察等手段证实空心瓜与冬瓜具有较近的亲缘关系，为空心瓜的系统分类奠定了基础。本研究通过对空心瓜的形态学观察，同样发现其与冬瓜具有许多相似之处。比如空心瓜的果实形状与小冬瓜相似、种子形状与冬瓜的双边籽类似、幼果均被较多长茸毛等。

本研究进一步利用ITS序列研究空心瓜的系统分类。ITS具有进化速率快、稳定性好、测序方便等特征，是研究植物分类和亲缘关系的重要工具，可解决在不同植物类群中科内的系统发育和分类问题[10-15，22]。Sharma等[22]利用ITS序列对从印度东北部收集到的兰科植物进行系统分类研究。侯新东等[14]以ITS序列研究庐山地区12种荨麻科植物的系统发育关系，结果发现其分类结果与传统形态学的分类结果基本一致。

本研究首先克隆了空心瓜的ITS序列，并与葫芦科其他作物进行系统进化分析，结果显示空心瓜与冬瓜的遗传距离仅为0.03，远低于与其他葫芦科作物的距离；系统进化分析结果表明，空心瓜与冬瓜均归属于Benincaseae冬瓜亚族，且位于于同一个进化树的分支末端。综上所述，空心瓜与冬瓜亲缘关系较近，归属于冬瓜属。本研究不仅为空心瓜的系统分类提供了更为直接的分子证据，而且为空心瓜优异基因的挖掘利用及冬瓜种质资源拓宽奠定了重要的研究基础。

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