萘乙酸对橡胶树胶胞炭疽菌生长速率、孢子萌发率和附着胞形成率的影响

郑肖兰　胡飞　梁艳琼　吴伟怀　郑金龙习金根　李锐　贺春萍　易克贤

摘 要 橡胶树炭疽病是影响橡胶树割胶生产的重要病害之一，主要由胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌侵染引起的，在世界各大植胶地区引起了无数橡胶树叶片脱落，甚至整株死亡，给当地的橡胶产业发展造成了严重损失。本实验主要采用菌落生长速率法、孢子萌发测试法等常规植物病理学方法研究萘乙酸对橡胶树胶胞炭疽菌RC169生长速率、孢子萌发率和附着胞形成率的影响。结果表明，低浓度时萘乙酸对RC169菌丝生长、孢子的萌发和附着胞的形成具有促进作用，但随着用药浓度的升高，其促进作用变为抑制作用，且抑制作用随之规律性增强。

关键词 萘乙酸 ；橡胶树胶胞炭疽菌 ；抑菌率 ；孢子萌发率 ；附着胞形成率

中图分类号 S682.19；S794.2 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.08.010

Abstract The anthracnose is one of the most important diseases that affect the production of rubber tree. The anthracnose is caused by the infection of Colletotrichum gloeosporioides and C. acutatum， which makes rubber leaves fall from trees， and causes serious losses of local rubber industry. This experiment was to explore the effect of NAA on C. gloeosporioides RC169's mycelial growth， spore germination and appressorium formation. The results showed that when NAA has low concentrations， it has promotion effect on the mycelial growth， spore germination and appressorium formation of RC169. With the NAA concentration increasing， the inhibition effect on mycelial growth spore germination and appressorium formation is strengthened.

Keywords NAA ； Colletotrichum gloeosporioides ； mycelial growth rate ； spore germination rate ； appressorium formation rate

橡胶树炭疽病是影响橡胶树割胶生产的重要病害之一。橡胶树炭疽病主要由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C. acutatum）侵染引起，可导致世界各大植胶地区无数橡胶树叶片脱落，甚至整株死亡，给当地的橡胶产业发展造成了严重损失[1]。橡胶树炭疽病一直以来是制约橡胶产量的重要因素之一，其病原菌主要侵染橡胶树叶片的幼嫩部位，导致橡胶树叶片组织坏死或大量脱落，严重时造成大量落叶和嫩梢回枯，树体衰弱，缩短割胶期限，推迟开割时间，导致橡胶总产下降。自1906年斯里兰卡Peteh首次报道以来，已有十几个植胶国家先后报道有此病发生。中国1962年在海南国营大丰农场苗圃首次发现，随着种植感病品系的增加，各植胶区陆续有其发生危害情况报道[2-3]。

萘乙酸（Naphthalene acetic acid，NAA）是一种用途较广的植物生长调节剂，可以提高种子中过氧化物酶和过氧化氢酶的完整性，对植物有促进发芽、生根、加速生长、提早成熟、增加产量等作用[4-5]。若能明确萘乙酸对橡胶树胶胞炭疽菌生长速率、孢子萌发和附着胞形成的影响，就可以深入研究其作用和影响的机理，从而对植物生长调节剂进行创新性改进，最后可望在利用萘乙酸调节橡胶树幼苗和老树生长的同时，对橡胶树炭疽病进行同步防治。这样既可以在橡胶树苗期和出新芽期等时期利用萘乙酸调节其生长，并防治橡胶树炭疽病，可望节省大量栽培和防治成本。

本实验主要研究萘乙酸对橡胶树胶胞炭疽菌RC169生长速率及其孢子萌发率和附着胞形成率的影响，以期为今后使用萘乙酸防治橡胶树炭疽病研究作好铺垫。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

橡胶树胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。

1.1.2 试剂

2.5%萘乙酸微乳液由安林生物化工有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 萘乙酸对生长速率的影响

PDA培养基：200 g/L马铃薯煮出液，10 g/L葡萄糖，18 g/L琼脂，121℃灭菌20 min。

萘乙酸含药培养基配制方法： ①计算好所需配置的药量，取标准用药量为中间值，向两边各取2个浓度梯度。②向25 mL容量瓶中加入药剂后，再加入2.5 mL DMF溶剂（分析纯，N，N-二甲基甲酰胺），加入适量（一般2滴）的助剂（消泡剂DX-10），然后定容至25 mL。③用系列浓度稀释法将药剂配出5个浓度梯度。④选择96 mL的培养基熔化，待温度适宜后分别向各培养基中加入4 mL不同浓度梯度的药剂，混合均匀并倒入培养皿制成含药培养基平板。⑤在各平板上接种供试菌株，并设置对照组。4～5 d后观察，测量，记录数据并拍照，根据以下公式计算出抑菌率：抑菌率（%）=（Φ1-Φ2）/（Φ1-D）。其中，D为打孔器的直径，本实验中D=0.5 cm；Φ1为对照组菌落直径平均值；Φ2为实验组菌落直径平均值。

1.2.2 萘乙酸对孢子萌发率和附着胞形成率的影响

根据预实验得出：RC169产孢快且量大，萌发条件易控制。孢子萌发判定方法：当芽管长度大于孢子自身宽度的1/2时，即视为萌发。

实验步骤：①水琼脂玻片制备，将1%或2%水琼脂熔化后，滴一滴水琼脂至载玻片上，然后迅速用涂布棒推平，等其晾干。②孢子悬浮液的制取，直接向已产孢的培养皿中加入4～5 mL无菌水，将孢子洗脱下来，然后用参试试剂将其配制成每个视野中40～50个孢子的孢子悬浮液。③将制备好的孢子悬浮液滴一滴于①中的载玻片上，将载玻片放入含有湿润滤纸的大培养皿中，置于28℃，湿度为90%恒温培养箱中。待孢子在T h（无菌水中萌发率超过80%所需要的时间）时，先用棉兰乳酚油固定，然后用计数器数出孢子总数，萌发数及附着胞形成数目，算出孢子萌发率及附着胞形成率。④根据以上方法先进行预实验，得出RC169的T h。然后根据得出的T h进行实验，计算孢子萌发率[6]。

2 结果与分析

2.1 萘乙酸对生长速率的影响

萘乙酸对RC169生长速率影响结果见图1。从图1可看出，随着萘乙酸参试浓度从0.4到64 μg/mL规律性增大，RC169对应的抑菌率则呈现规律性增加，分别为0.0、2.1%、0.6%、11.7%、14.7%、34.6%。总体上，随着萘乙酸浓度的升高，RC169各菌落直径随之变小。通过处理原始数据，计算得出表1的结果。从表1处理得出相关的回归方程y=0.542 2x-0.588 6，R2=0.968，差异达到极显著，具体如图2。实验结果表明：植物生长调节剂萘乙酸在一定的浓度范围内对橡胶树炭疽菌RC169的生长速率有一定的抑制作用。

2.2 萘乙酸对孢子萌发率和附着胞形成率的影响

萘乙酸对RC169孢子萌发率和附着胞形成率的影响结果见表2。经多次试验发现，RC169孢子萌发率超过80%以上的T=12 h。由表2可知，随着萘乙酸浓度从0.00、0.04到10.20 μg/mL，RC169 的平均孢子萌发率分别为80.2%、90.6%、83.7%、56.7%、53.3%、31.3%；平均附着胞形成率则为 68.8%、85.3%、54.5%、22.5%、19.7%、2.7%；表明在萘乙酸0.04 μg/mL浓度下，RC169 的孢子萌发率和附着胞形成率均比对照稍大，但在总体上随着萘乙酸浓度的升高，橡胶树炭疽菌RC169的孢子萌发率和附着胞形成率随之降低，差异显著。为了更直观地分析结果，依据数据求其相应的线性回归方程，得出图3和图4。

由图3可推出，孢子萌发率的回归方程：

y=-10.954x+104.31，R2=0.816 5；孢子萌发结果差异达到极显著。

附着胞形成率的回归方程：

y=-15.978x+98.178，R2=0.864 3；附着胞形成结果差异达到极显著。

总体而言，随着萘乙酸浓度的升高，橡胶树炭疽菌RC169的孢子萌发率和附着胞形成率随之降低。但在0.04 μg/mL时的孢子萌发率和附着胞形成率都比对照组大；从而推断，在极低浓度下，萘乙酸对RC169孢子的萌发和附着胞的形成有一定的促进作用。

3 讨论

本实验表明：在一定浓度范围内2.5%萘乙酸微乳液，对橡胶树胶胞炭疽菌RC169的生长速率具有抑制作用，且随着用药浓度的升高，其抑制作用相应增强。此外，在一定极低浓度范围内2.5%萘乙酸微乳液，对橡胶树胶胞炭疽菌RC169孢子萌发和附着胞的形成也具有促进作用；随着用药浓度的增加，其对RC169的孢子萌发率和附着胞形成率由促进作用变为抑制作用。由此可以推测，一定条件下，极低浓度的萘乙酸可以增强炭疽菌RC169的抗逆性能力，从而增强孢子萌发率和附着胞形成率；随着萘乙酸浓度的升高，其促进作用会变为抑制作用。

杀菌剂对胶胞炭疽菌抑制作用的主要方式是抑制菌丝生长、芽管伸长和分生孢子萌发[7]。本试验的结果与前人一般的药剂敏感性结果一致，如郑金龙通过9 种杀菌剂对柱花草胶孢炭疽病菌的室内毒力测定结果[8]，刘永刚采用抑菌圈法和孢子萌发法测定枸杞炭疽病菌对19种药剂的敏感性以及各种药剂对孢子萌发的抑制作用[9]，曲健禄采用菌丝生长速率法测定7 种常用杀菌剂对柿树炭疽病菌的抑制作用[10]。本试验发现萘乙酸对胶胞炭疽菌RC169的抑制作用属于首次报道，萘乙酸对RC169孢子的萌发和附着胞的形成的促进作用也未见报道，其作用原理还需要进一步深入研究。

本实验过程中，由于水分、光照、培养基厚度等因素的不一致，导致生长速率的测定结果不尽相同，给实验结果造成一定的误差；其次在孢子萌发率和附着胞形成率影响的测定过程中，由于每次滴在玻片上的水分、水琼脂厚度、显微镜光线等因素不尽相同，致使实验过程中，同一处理结果出现较大差异，这与以往文献的报道相同[11-12]，更好更稳定的测试方法还有待进一步的探索。

参考文献

[1] 郑肖兰，崔昌华，郑服丛，等. 橡胶炭疽病病原菌生物学特性初步研究[J]. 微生物学通报，2006，33（1）：95-99.

[2] 王兰英，张 宇，郑肖兰，等. 8种杀菌剂对橡胶炭疽菌的抑制活性[J]. 农药，2010，03：16-20.

[3] 李 琳，崔昌华，郑肖兰，等. 海南岛橡胶炭疽菌基础生物学特性研究[J]. 热带农业科学，2007，04：24-27.

[4] 唐为萍，陈树思，陈丹生，等. 萘乙酸对芥蓝根、芽生