气相色谱-串联质谱法检测大米中20种农药残留

陈　溪，董振霖，孙玉玉，尚宝玉，刘佳成，曲世超，纪明山

(1.沈阳农业大学　植物保护学院，辽宁　沈阳　110866;2.大连出入境检验检疫局　检验检疫技术中心，

辽宁　庄河　116400;3.辽宁出入境检验检疫局　检验检疫技术中心，辽宁　大连　116001)

气相色谱-串联质谱法检测大米中20种农药残留

陈溪1,2，董振霖3，孙玉玉3，尚宝玉2，刘佳成2，曲世超2，纪明山1*

(1.沈阳农业大学植物保护学院，辽宁沈阳110866;2.大连出入境检验检疫局检验检疫技术中心，

辽宁庄河116400;3.辽宁出入境检验检疫局检验检疫技术中心，辽宁大连116001)

摘要：建立了两种可简便、灵敏、快速、批量测定大米中20种农药残留的分析方法。样品经乙腈提取后，使用C18固相萃取柱(SPE)和QuEChERS两种不同净化方法，采用气相色谱-串联质谱选择反应监测(SRM)模式对20种农药进行检测，通过保留时间、选择离子及其相对丰度定性，外标法定量。结果表明，20种农药的线性范围为0.01 ～0.2 μg/mL，相关系数均大于0.99。在0.01，0.05，0.20 mg/kg加标水平下，采用C18柱对大米样品进行提取净化，20种农药的平均回收率为63.3%～96.0%，相对标准偏差(RSD)为1.9%～13.9%;采用QuEChERS方法对大米样品进行提取净化，20种农药的平均回收率为67.7%～121.0%，RSD为1.9%～16.4%。此两种方法无明显差异，为农药多残留检测提供了不同的思路，能够对大批量大米样品进行同时检测，数据准确可靠，回收率与精密度均符合农药残留的分析要求。

关键词：大米;农药残留;气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS);QuEChERS;固相萃取(SPE)

大米是人们的主要粮食。1990年以来，得益于农药及化肥的使用，水稻的生产率以每年0.4%的速度增长。虽然使用农药能够有效控制杂草与病虫害，但农作物可能由此受到严重污染，因此对大米产品的农药残留监控关系着人们的身体安全与食品安全[1]。国际食品法典委员会(CAC)[2]、欧盟委员会(European Commission)[3]、美国环境保护署(USEPA)[4]等各国相关组织及部门纷纷建立了食品中最大残留限量要求(MRLs)，我国也于2014年实施了国家标准GB 2763-2014《食品中农药最大残留限量》，涉及农药387种、检测项目达3 650项[5]。

随着农药残留标准的日益严格及农药残留检测项目的不断增多，建立简便、快速、重现性高的农药多残留检测方法迫在眉睫。目前常用的样品前处理方法包括QuEChERS法[6-11]、凝胶渗透净化色谱(GPC)[12-14]、固相萃取(SPE)[15-16]净化方法;而农药多残留的检测技术，也逐渐以质谱检测技术为主导[17]。虽然气相色谱(GC)、气相色谱质谱联用(GC-MS)技术在农药残留的检测中有着重要作用，但GC法由于基质的干扰，常遇到某些农药不易定性问题，可能会出现许多杂质峰或造成假阳性结果;GC-MS在一定程度上解决了GC法面临的假阳性问题，但对复杂样品的检测仍存在严重的基质干扰情况，较难鉴定目标物的分子结构[18-20]。因此，高选择性、高灵敏度、高分辨率的多农残同时筛查定性和确证定量分析手段应运而生，其中气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)较一级质谱有着更强的抗干扰能力，能够实现农药的定量与定性筛查分析[1,21-26]。

辽宁地区作为大米的主产地，大米产品主要出口日本、韩国等。目前，针对谷物的农残检测方法以GB/T 20770-2008《粮谷中486种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》、GB/T 19649-2006《粮谷中475种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》、SN/T 2149-2008《进出口食品中解草嗪、莎稗磷、二丙烯草胺等110种农药残留量的检测方法 气相色谱-质谱法》为主，而文中涉及的20种农药，均为2014年新增的输韩大米检测项目，与GB/T 20770-2008相比有11种农药在该标准中未涉及;与GB/T 19649-2006相比，有5种农药在该标准中未涉及;与SN/T 2149-2008相比有12种农药在该标准中未涉及。且迄今为止尚无气相色谱-串联质谱的检测标准，该方法的建立对科研人员及一线检测人员有一定借鉴意义，能够为出口大米的检验和产品的质量控制提供科学依据和技术支持。

1实验部分

1.1仪器及试剂

气相色谱-串联质谱仪(GC-MS/MS，美国Thermo公司)，配电子轰击源(EI);电子天平(AE 260，瑞士梅特勒公司);均质机(T 25 digital ULTRA-TURRAX，德国IKA公司);离心机(Z-323 k，德国赫默公司);旋转蒸发器(R215-PROV-V700，BIBBY RE 100);UniElut C18EC(2 000 mg/12 mL，中国华谱Acchrom公司)。

标准品：克草敌、氟丙嘧草酯、氯甲酰草胺、溴丁酰草胺、二丙烯草胺、苯胺灵、九氯、六氯苯，购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH。环庚草醚、酞菌酯、氯酞酸甲酯、灭藻醌、毒草胺、乳氟禾草灵、炔苯酰草胺、二甲草胺、四溴菊酯、莠灭净、扑灭津、戊环唑，购自美国Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH。农药标准品纯度均大于98%。

乙腈、甲醇、丙酮(色谱纯，美国Fisher公司);乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)粉末(Bondesil-PSA，40 μm，美国瓦里安公司);C18粉末(Octadecyl，40 μm，美国J.T.Baker公司);无水硫酸镁、NaCl(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)。无水硫酸镁在650 ℃下灼烧4 h，冷却至120 ℃后，置干燥器中备用;实验用水为高纯水。

1.2标准溶液配制

标准储备液：准确称取20种农药标准品各10 mg(精确至0.1 mg)分别置于10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，得到质量浓度为1 000 μg/mL的农药标准储备液，并储存于4 ℃冰箱中。

混合标准储备液：准确移取25 μL上述1 000 μg/mL标准储备液于10 mL容量瓶中，用丙酮定容，得到质量浓度为2.5 μg/mL的混合标准储备液，储存于4 ℃冰箱中。

混合基质标准工作溶液：为避免基质效应，配制基质标准工作液作为定量依据。用阴性空白样品提取液作为溶剂，得浓度分别为0.01,0.025,0.05，0.1，0.2 μg/mL的混合基质标准工作溶液。

1.3样品前处理

1.3.1C18柱净化法提取：称取10.0 g(精确至0.1 g)磨碎的大米(过20目筛)，置于100 mL离心管中，加入30 mL乙腈，匀浆3 min，4 000 r/min离心10 min，上清液转移至鸡心瓶，残渣部分再加入20 mL乙腈，经匀浆离心后，合并提取液。真空浓缩至干(48 ℃，110 r/min)，用5 mL乙腈溶解，待净化操作。

净化：将C18(UniElut C-18 EC，2 g/12 mL)SPE柱用10 mL乙腈预淋洗，取2.5 mL上述提取液上样并收集，用20 mL乙腈分3次洗脱C18柱，合并后浓缩至干。用2 mL丙酮溶解，供GC-MS/MS检测。

1.3.2QuEChERS法提取：称取10.0 g(精确至0.1 g)磨碎的大米(过20目筛)至50 mL离心管中，加入10 mL高纯水，浸泡30 min后加入10 mL乙腈、4 g无水MgSO4和1 g NaCl，振摇3 min，离心(4 000 r/min，5 min)。

净化：在2 mL离心管中加入50 mg PSA、50 mg C18粉末和150 mg无水MgSO4，移取提取液1 mL，振荡混匀1 min后离心(4 000 r/min，5 min)，取上清液供GC-MS/MS检测。

1.4GC-MS/MS条件

色谱柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm);载气：氦气，纯度≥99.995%，流速：1.0 mL/min;色谱柱温度：70 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至230 ℃，再以30 ℃/min升至280 ℃，保持10 min;进样口温度：250 ℃;气相色谱-串联质谱接口温度：250 ℃;进样量：1 μL;进样方式：无分流进样，1.0 min后开阀;电离方式：EI;电离能量：70 eV;测定方式：选择反应监测方式(SRM);溶剂延迟：3 min。每种化合物通过GC-MS/MS检测的保留时间、离子对等相关参数见表1。

表1　20种农药的质谱分析参数

2结果与讨论

2.1提取溶剂的选择

大米为干样品，提取前需加水使其充分浸润，以保证提取剂与样品充分接触。根据农药的化学性质，选择甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯作为提取溶剂，对大米样品进行提取实验，并对提取效果进行比较。结果表明，采用乙酸乙酯、二氯甲烷作为提取溶剂时，会提取出更多的脂肪类杂质，不利于后续净化;甲醇作为提取剂时部分可溶性淀粉和水分会被一并萃取，导致旋转蒸发的温度过高，回收率偏低，且提取液被蒸干后，淀粉残留在瓶壁上，增加了提取液转移的难度，回收率结果不稳定。丙酮作为萃取剂蒸干后也会有水分残留，需要增加除水的操作步骤，而且其对脂肪类油脂的萃取物也较多，同样对回收率有较大影响。使用乙腈作提取剂时，对色素和基质中的蜡质、脂肪等非极性成分的提取能力相对较小。此外，乙腈能与水形成共沸物而将水分蒸出，无需除水，其提取效率更高。因此最终采用乙腈作为提取溶剂。

2.2净化方法的研究

2.2.1C18柱洗脱液的选择其他因素固定，采用不同比例的甲醇-乙腈溶剂作为洗脱液。结果显示，随着洗脱液中乙腈比例的上升，20种农药的回收率不断提高，故实验选择纯乙腈作为洗脱溶剂。

2.2.2C18柱洗脱液体积的选择其他因素固定，以不同体积的乙腈(5,10,20,30,40,50 mL)作为洗脱液，测定20种农药的回收率。结果显示，随着洗脱液体积的增大，农药的回收率呈先上升后下降的趋势，其原因可能是由于洗脱液用量过多，旋蒸时间过长，造成了农药的损失，反而使其回收率降低。当洗脱溶剂为20 mL时，20种农药的萃取效果最好,其回收率均在70%～110%之间。

2.2.3QuEChERS法QuEChERS是一种快速、简单、廉价、高效、耐用、安全的样品前处理方法，参考AOAC 2007.01[27]、EN 15662[28]及文献方法[29]，对盐析剂和吸水剂进行选择。常用的盐析剂为NaCl 和CH3COONa，吸水剂为无水Na2SO4和无水MgSO4。对于两种盐析剂而言，NaCl和CH3COONa对回收率无显著影响，20种农药的平均回收率相差在2.7%以内。而无水MgSO4的吸水能力更佳，在吸水过程中放热，有利于农药的提取;且无水MgSO4粒度更小，在振摇与涡旋的过程中可与样品混合得更加充分，并通过与乙腈的协同作用，提高提取效率。因此，最终确定采用文献方法[29]，即加入1 g NaCl与4 g无水MgSO4。

另外，QuEChERS方法在净化过程中，常采用PSA吸附剂除去样品基质中的脂肪酸、有机酸和糖等杂质，石墨化炭黑(GCB)去除色素和甾醇，用C18反相吸附剂除去基质中的脂肪和脂类等非极性有机物，并通过加入无水MgSO4进一步除水，以提高农药的萃取率。考察了添加50 mg PSA、50 mg C18或25 mg PSA、25 mg C18作为净化剂时的净化效果，结果表明，以50 mg PSA、50 mg C18为净化剂时，基质效应相对较小，净化效果较好，20种农药的回收率为85.5%～106.4%。因此，本实验在净化过程中仅添加PSA及C18。

2.3质谱条件的优化

图1　20种农药的总离子流图Fig.1　TIC of 20 pesticides standard solutionthe number represented is the same as that in Table 1

将1 μg/mL的20种农药单标溶液进行单级质谱全扫描，选择其中有代表性的母离子碎片;对每个母离子进行碰撞能优化，根据子离子扫描质谱图，选取最佳的定性和定量离子对。最终确定各农药的母离子、子离子、碰撞能量、扫描时间等参数(见表1)。在上述优化条件下，20种农药均得到较好的分离，混合基质标准工作溶液的总离子流色谱图见图1。

2.4基质效应的考察

基质效应是指相同浓度的目标物在纯溶剂和基质中的响应存在较大差异，在气相色谱中主要表现为基质增强效应。这是由于基质成分的存在减少了色谱系统活性位点与待测物分子作用的机会，使得待测物的检测信号增强。不同目标物、不同基质、不同前处理方法以及不同的仪器状态下，其基质效应差别较大[10]。消除基质效应影响的方法主要有：加入内标化合物、基质匹配标准工作溶液、加入分析保护剂、应用更多的净化步骤等。本研究采用基质匹配标准溶液建立标准工作曲线，对基质效应进行补偿。

通过对基质标和溶剂标工作曲线斜率的比较，发现采用C18净化时，只有六氯苯、扑灭津、溴丁酰草胺、环庚草醚、灭藻醌和九氯6种农药不存在基质效应;而采用QuEChERS前处理方法，克草敌、毒草胺、六氯苯、扑灭津、戊炔草胺、二甲草胺、溴丁酰草胺、环庚草醚、灭藻醌、氯酞酸甲酯、九氯和戊环唑12种农药均不存在基质效应。实验结果显示，采用QuEChERS前处理方法，农药的基质效应相对较小，上述12种农药可以采用标样直接配制工作曲线。

2.5线性范围、相关系数及定量下限

分别按照乙腈提取-C18柱净化/GC-MS/MS(方法1)与 QuEChERS/GC-MS/MS(方法2)得到空白大米样品基质液，制备标准工作曲线溶液，20种农药的浓度在0.01～0.2 μg/mL范围内与测得的峰面积呈良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99，具体数据见表2。分别以3倍和10倍信噪比确定化合物的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，除二丙烯草胺和四溴菊酯的LOQ为10 μg/kg外，其他18种农药的LOQ均小于5 μg/kg。满足美国、欧盟、“日本肯定列表”及有关国家对这20种农药的最高残留限量(MRLs)要求和方法检测灵敏度的要求。

2.6回收率与精密度

按照C18柱净化与QuEChERS净化对阴性大米样品进行加标回收实验，加标水平分别为0.01，0.05，0.20 mg/kg，每个浓度做6次平行，计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)，结果见表2。从表2数据可知，采用C18柱对大米样品进行提取净化，20种农药的平均回收率为63.3%～96.0%，RSD为1.9%～13.9%;采用QuEChERS法大米样品进行提取净化，20种农药的平均回收率为67.7%～121.0%，RSD为1.9%～16.4%。此两种方法无明显差异，均能对批量大米样品进行同时检测，且数据准确可靠，回收率与精密度均符合农药残留的分析要求。

表2　两种方法的回收率与精密度

2.7大米样品分析

采用方法1与方法2对市场上购买的3个东北大米、1个盘锦大米、1个泰国大米、1个五常大米样品中的20种农药残留进行分析，每个样品平行试验3次，结果均未检出上述20种农药。

3结论

本文建立了大米样品中20种不同种类农药残留的两种GC-MS/MS检测方法。方法1采用乙腈提取、C18固相萃取净化、GC-MS/MS分析;方法2采用乙腈提取、QuEChERS法净化、GC-MS/MS分析。该研究为农药多残留检测提供了不同的思路，方法具有灵敏度高、操作简单快捷、重现性好且回收率高的特点，适用于大米中多组分农药残留的定量检测与定性确证，在日常实际检测中取得了满意的结果。

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Determination of 20 Kinds of Pesticide Residues in Rice by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Xi1,2，DONG Zhen-lin3，SUN Yu-yu3，SHANG Bao-yu2，LIU Jia-cheng2，QU Shi-chao2，JI Ming-shan1*

(1.Plant Protection College，Shenyang Agricultural University，Shenyang110866，China;2.Dalian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Technology Center，Zhuanghe116400，China;3.Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Technology Center，Dalian116001，China)

Abstract：Two analytical methods for the simultaneous determination of 20 pesticide residues in rice were proposed.The rice samples were initially extracted with acetonitrile(MeCN)， then cleaned up by C18SPE column(method 1) and QuEChERS method(method 2)，respectively.The extract was analyzed by GC-MS/MS under selective reaction monitoring(SRM) mode，in which the pesticides were identified by retention time，selected ions and their relative abundances，and quantified by the external standard method.The results indicated that the linear ranges of pesticides were between 0.01 μg/mL and 0.2 μg/mL，with correlation coefficients all above 0.99.At three spiked concentration levels( 0.01，0.05,0.20 mg/kg)，the average recoveries of 20 pesticides in rice purified by method 1 ranged from 63.3% to 96.0%，with relative standard deviations(RSDs) of 1.9%-13.9%.The average recoveries of 20 pesticides in rice purified by method 2 ranged from 67.7% to 121.0%,with RSDs of 1.9%-16.4%.The results showed that there was no obvious difference between two pretreatement methods，and this study provided a different pretreatment way for pesticide residue detection.The proposed method was suitable for the simultaneous determination of multiple pesticide residues in rice.

Key words：rice;pesticide residues;gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS);QuEChERS;solid phase extraction(SPE)

收稿日期：2015-08-01;修回日期：2015-10-10

基金项目：国家质检总局科研项目(2010IK134)

*通讯作者：纪明山，博士，教授，研究方向：农药毒理学，Tel:024-88492673，E-mail：jimingshan@163.com

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.004

中图分类号：O657.63;F767.2

文献标识码:A

文章编号：1004-4957(2016)04-0394-06