猪瘟的实验室诊断与预防措施

张永香/福建福州大北农生物技术有限公司 陈海南/湖北襄阳襄州畜牧兽医局



猪瘟的实验室诊断与预防措施

张永香/福建福州大北农生物技术有限公司 陈海南/湖北襄阳襄州畜牧兽医局

猪瘟俗称“烂肠瘟”，是一种高度接触性传染病，遍布全世界，世界动物卫生组织将此病列为A类传染病之一，我国也将其列为一类传染病。该病是由猪瘟病毒(CSFV)引起猪的一种常见烈性传染病，主要通过呼吸道和消化道传染，一年四季都可发生，以春夏多雨季节为多，传播速度快，发病率高，死亡率高。感染猪在潜伏期即可向外排毒；感染强毒株的病猪可持续排毒直至死亡，幸存者持续排毒到产生抗体；中等毒力或低毒力毒株会引起慢性传染，可持续排毒或间歇性排毒到死亡。我国各地虽然对猪瘟都积极进行免疫，但猪瘟仍时有发生，并且非典型和温和型猪瘟病例逐渐增多，造成的经济损失甚为惨重。主要传播是通过直接或间接与感染野猪或家猪接触经口鼻传播，或食入被污染的饲料。种公猪筛选不当，可通过配种将病毒传播给受配母猪。患病母猪可经胎盘直接感染胎儿，诱发仔猪发病。消毒隔离不严，人群被视为猪群之间重要的传播因素。

一、流行病学

家猪和野猪是猪瘟病毒的自然宿主，病猪和带毒猪是最主要的传染源。在自然环境下，传播途径为口鼻传播、精液传播和胎盘传播。

二、临床症状

（一）急性型

由猪瘟病毒强毒株引起，潜伏期在24～72 h，临床上常见，病猪体温41℃左右，呈稽留热，喜欢卧地，弓背，走路摇晃或打寒战，食欲减退甚至废绝，饮水量增加，部分患猪可发生呕吐。结膜发炎充血，眼睛有脓性分泌物，流脓性鼻涕。病初便秘，后期出现腹泻，粪便恶臭带粘液或血液。鼻端、耳后根、腹部及四肢内侧皮肤及牙龈、唇内、肛门等黏膜处出现针尖状出血，由病初的充血逐渐发展为出血斑或发绀；腹股沟淋巴结肿大。有些病猪出现神经症状，磨牙、转圈、强直及游泳样，甚至昏迷。公猪包皮发炎，用手挤压时有浑浊的液体射出，恶臭难闻。怀孕母猪感染低毒力猪瘟病毒可表现为流产、产死胎、畸形胎、胎儿干尸化、弱胎或外观健康但已经感染的带毒仔猪。

（二）慢性型

多由急性型转变而来，体温时高时低，主要表现为消瘦、贫血，全身衰弱，常伏卧、步态缓慢无力、食欲不振、便秘与腹泻交替；有的病猪在耳端、尾尖及四肢皮肤上出现紫斑或坏死痂，病程一般在20 d以上，最后死亡，耐过猪成僵猪。

（三）迟发性

多数见断奶后仔猪及架子猪，症状不明显，较轻微，病情缓和，病程较长，皮肤无出血点。但有瘀血和坏死，食欲不振，排便时干时稀，致死率较高。耐过猪生长发育受阻，母猪耐过后长期带毒，受胎率低、流产、死胎、木乃伊胎或畸形胎，所生仔猪先天感染，死亡或成为僵猪。

三、病理变化

（一）急性型

白细胞及血小板减少，全身皮肤、浆膜和内脏器官有不同程度的出血；全身淋巴结肿大、多汁、充血、出血，呈暗红色，切面周围出血明显，整个切面成红白相间的大理石样纹理或黑红色外观；典型症状是脾脏边缘可见缺血性梗死；肾脏表面有密集或散在的大小不一的出血点或出血斑，出血部位以皮质表面最为常见，呈现所谓的“雀斑肾”外观；盲肠、回盲瓣口及结肠黏膜出现有特征性的伪膜性坏死和大小不一的圆形纽扣状溃疡；喉头、会厌软骨、膀胱黏膜以及心外膜等也出现出血点或出血斑。

（二）慢性型

全身性出血变化不明显，主要表现为坏死性肠炎，在盲肠、回盲瓣口及结肠黏膜上形成同心轮状的纽扣状溃疡，突出于黏膜表面，颜色呈褐色，中央凹陷；全身淋巴组织萎缩；有诊断意义的是由于钙磷失调表现为突然钙化，从肋骨、肋软骨联合到肋骨近端常见有半硬的骨结构形成的明显横切线。

（三）迟发性

最典型的病理变化是胸腺萎缩，外周淋巴器官严重缺乏淋巴细胞。

四、实验室诊断

根据临床症状和病理变化可做初步诊断，确诊需要进行实验室诊断。目前已建立了多种对猪瘟抗原的检测方法，下面主要介绍免疫荧光试验、病原分离和回归试验及琼脂扩散试验3种检测方法。

（一）免疫荧光试验

此法简便、快速、检出率较高，许多国家和地区已将其作为猪瘟的法定诊断方法，此法也是我国进行实验室诊断的最常用方法之一。

1.直接免疫荧光试验。采取病料：取早期病猪或死亡猪的扁桃体、淋巴结和脾；中后期病猪取胰脏；病程长的患病猪以采集肾或副肾为宜。制成触片或冰冻切片，室温下用丙酮固定15 min，取出立即放入0.01 mol/L pH7.2的PBS中，轻轻漂洗3～4次。取出自然干燥后，尽快进行荧光抗体染色。将猪瘟荧光抗体滴加于切片表面，置湿盒内于37℃作用30 min。取出后放入PBS中充分漂洗，最后用无离子水冲洗，自然干燥。再用0.5 mol/L pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲甘油封片，置荧光显微镜（激发光为蓝紫光或紫外光）下检查。如在扁桃体隐窝上皮细胞内或肾曲小管上皮细胞浆内见有黄绿色荧光斑（强毒株荧光明显，弱毒株仅有微弱的荧光斑），即可判为猪瘟感染阳性。青灰色或带橙色为阴性。如反差不明显，亦可用1％伊文思蓝复染，但需注意，复染后不要过度脱色。也可用猪源原代细胞或传代细胞作单层培养时，加入盖玻片。当形成单层时，种入病猪脾或其他组织浸出液，培养24～48 h，取出盖玻片，风干、固定。用荧光抗体染色，方法同上。如细胞胞浆内有亮绿色荧光斑，可判为阳性。

2.间接免疫荧光试验。在病料组织片上，滴加1∶4抗猪瘟阳性血清，作用30 min后洗涤。再加羊抗猪IgG荧光抗体作用30 min，漂洗、干燥，进行荧光检查，判定方法同上。此法简易快速，可在2～3 h内得出结果，检出率可达91％～100％，但非特异性染色仍是一个值得注意的问题。

（二）病原分离和回归试验

这是最经典和可靠的方法。采集病变典型的可疑组织，包括血液或脏器，经研磨、超声裂解、差速离心提取病毒，一方面可作病原检测，另一方面再将病毒回归到健康动物体内，观察是否出现猪瘟的典型症状。本法特异性高、敏感性强，最具诊断价值，但耗时、耗财。

1.病料的采集和处理。应采集扁桃体、脾、肾和回肠末段。扁桃体是猪瘟病毒感染后最先能检测出病毒抗原阳性的组织，因而扁桃体是急性病例的首选病料。回肠末段则是慢性病例的首选病料。病料应从多个病猪采集。采集的病料不加防腐剂、置低温环境（冰盒中）中，尽快送到实验室检测。实验室通常采用直接免疫荧光法和接种细胞培养分离病毒的方法进行病原学诊断。用荧光法检测的病料要新鲜，用于病毒分离的病料还应过滤除菌。

2.病毒分离。用猪肾、睾丸的原代、次代或传代细胞均可。病料经研磨、离心、过滤除菌后接种细胞培养，细胞不出现病变。通常用荧光抗体法可测出细胞培养中盖玻片上细胞浆内的病毒抗原，亦可用新城疫病毒强化试验检测猪瘟病毒的存在。

3.猪体回归感染试验。猪是猪瘟病毒唯一的易感动物，用其作为实验动物诊断本病是最可靠的方法。将易感仔猪（10～20 kg）分为三组，每组3～5头。其中，一组接种猪瘟疫苗，另一组皮下注射猪瘟抗血清（1 ml/kg体重）。1周后三组同时接种被检病料（血毒或病料乳剂1 ml/kg），继续饲养2～3周。疫苗和抗血清免疫组不发病，未免疫组呈现临床症状和病理变化，即可确诊。该试验结果确实可靠，但此过程需要严格的隔离条件，且耗时较长，仅在特别需要（如重要疫情）时及其它诊断方法很难确诊时使用。

（三）琼脂扩散试验

通常采用双向双扩散法，可选用病猪脾、淋巴结做抗原（脾脏较好）。该法是将琼脂糖按1％浓度加入pH8.6的硼酸盐缓冲液中煮沸溶解，倒入平皿中，冷却后置4℃保存。临用时打孔，最常用的是在凝胶板上作成7孔图形（中央打1孔，周围打6孔）。检测抗原时，在中央孔加入足够效价的抗血清，周围孔加已知抗原、阴性抗原和待检样品，置湿盒内于37℃孵育。待检样品为阳性时，可于24～72 h内出现沉淀线。由于抗原扩散较慢，常需在加抗血清之前2～4 h加入孔中。本法取材方便、操作简单、易于判定，既可检测抗原，也可检测抗体，而且此法在病的急性期检出率最高，但敏感性低，故一般不采用。

五、预防措施

（一）免疫接种

该病尚无特效药物，采取免疫预防和及时淘汰感染猪是预防的最佳选择。可接种的免疫疫苗，有猪瘟弱毒疫苗或与猪丹毒、猪肺疫制成的二联苗或三联苗。同时开展免疫监测，了解抗体保护水平。对免疫猪群定期用酶联免疫吸附试验或正向间接血凝试验等方法开展抗体监测试验，了解免疫猪群是否达到有效保护水平。建立种公猪及种母猪血清监督系统和有效的公猪认证及记录系统。避免生产出感染仔猪形成恶性循环，应用4倍量猪瘟兔化弱毒疫苗对能繁母猪进行配种前注射，结合检测淘汰隐性感染猪。

（二）加强饲养管理

加强饲养管理，提高整个猪群的抵抗力。做好猪场的隔离、卫生、消毒和杀虫工作，减少猪瘟病毒的侵入。在生产区时，饲养员之间避免或尽量减少接触，减少传染的概率。购买种猪时，杜绝到疫区购买，严格检疫程序。新进的猪应该隔离观察21 d，确认是健康的猪之后再进行合群饲养。配种选择优质种公猪、种母猪，严格检查精液质量，避免生产弱胎、畸形胎。

六、小结

猪瘟被我国列为一类动物疫病，发病急，死亡率高，发现应立即上报，划定疫区，淘汰感染猪，避免出现大范围暴发。免疫接种是猪瘟最佳的预防选择，同时加强饲养管理，提高猪群抵抗力。根据临床症状和病理变化可做初步诊断，确诊需要进行实验室诊断，常用的检测方法有免疫荧光试验、病原分离和回归试验和琼脂扩散试验等，养殖户可根据实际条件进行实验室诊断，确保早确诊早隔离早淘汰，降低经济损失。