新疆北疆地区户用沼气微生物群落多样性分析

陈 竞,代金平,杨新平,古丽·艾合买提，买尔哈巴，冯 蕾

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐　830091)



新疆北疆地区户用沼气微生物群落多样性分析

陈 竞,代金平,杨新平,古丽·艾合买提，买尔哈巴，冯 蕾

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐830091)

摘要：【目的】从碳代谢的角度比较不同地区沼气池微生物群落功能多样性。【方法】以北疆户用沼气为研究对象，采用Biolog微平板技术，以DPS数据处理软件解析来自北疆四个不同地区沼液微生物群落碳代谢多样性。【结果】从平均颜色变化率(AWCD)看出，各组样品间微生物活性差异显著。多样性分析显示，水西沟组的Shannon指数较高。主成分分析显示，各组沼液微生物群落碳源利用特征存在明显差异，其中在PC1和PC2上起主要分异作用的碳源也各不相同。【结论】各组沼液微生物群落有很高的丰富度，并且存在明显差异，但地域性差别不明显。

关键词:沼液；微生物多样性；Biolog 生态板；碳代谢

0前 言

【研究意义】随着新疆经济的发展，大型规模化畜禽养殖场开始兴起，与此同时畜禽粪便及屠宰下水的环境污染问题也日益突出，沼气工程是养殖场废弃物污染治理的最主要解决办法[1-2]。通过发展沼气工程，规模化养殖场不但可以解决污染，还能获得有机肥和清洁能源，可谓一举三得。要想使得沼气装置高效稳定运行，除了现代智能化的沼气装置，高活性的沼气微生物种群，也是沼气池稳定高效运行的关键[3]。新疆地区冬季寒冷漫长，沼气池存在产气率低、使用率低、原料分解率低、沼气使用综合效益差等问题，尤其是北疆气温偏低，全年≥10℃的天数为38～144 d，绝大部分为次沼气适宜区和不适宜区[4]，因此了解北疆地区沼液微生物多样性，为开展北疆地区沼气产气的优化工作奠定基础。【前人研究进展】徐庆贤等[5]研究表明，沼气池中微生物种类丰富，并且拥有优势种群，主要有：稳杆菌属、热单细胞属、杜檊氏菌属、戈登氏菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌门、类群和厌氧细菌门。各细菌种类不同发酵层、不同发酵时间对微生物多样性存在影响。无论是传统的分离纯培养技术，还是PCR-DGG技术的应用都有其局限性[6-8]。针对沼液兼性厌氧微生物群落多样性研究分析技术的相关报道很少。【本研究切入点】尝试用Biolog微平板技术，从微生物群落碳代谢功能多样性的角度，分析北疆地区沼液兼性厌氧微生物群落多样性。【拟解决的关键问题】以北疆四个不同地区沼液样品为材料，通过Biolog微平板培养和读数，对不同地区沼气池微生物群落多样性进行分析，为实现沼气发酵的进一步优化和可控运行打下基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 采集地基本情况

四组沼液样品分别于2013年10月底采自塔城额敏、吐鲁番、伊犁特克斯、水西沟。这些户用沼气池均属国家惠民工程，额敏建在牧民安置小区，吐鲁番和特克斯建在农户庭院内沼气示范工程，水西沟则建在温室大棚内。列出采样点基本信息。表1

表1 户用沼气基本情况
Table 1Household biogas basic situation

地区Region农户Farmers规模Size(m3)室内/外Indoor/outdoor底物Substrate产气情况Biogasstatus维护情况Maintenance额敏e115室外牛粪夏季正常无Emine215室外牛粪低无e315室外牛粪夏季正常无e415室外牛粪良好有吐鲁番Tu110室外牛猪粪夏季正常有TurpanTu210室外牛猪粪停气无Tu310室外牛猪粪夏季正常有Tu410室外牛猪粪停气无Tu58室外牛猪粪夏季正常无特克斯TE115室内牛羊粪夏季正常有TekesTE210室内牛羊粪夏季正常无TE315室内牛羊粪低有TE415室外牛羊粪夏季正常无TE515室外牛羊粪低无TE615室外牛羊粪低无水西沟s110室内牛羊粪正常有Shuixigous210室内牛羊粪低无s310室内牛羊粪正常无

1.1.2 样品采集

从户用沼气池出料口经搅拌均匀后于浮渣下层取沼液装瓶，带回实验室4℃保存。用于Biolog 微生物群落功能多样性分析。

1.1.3主要试剂和仪器

Biolog-ECO板(美国)，Biolog 微生物鉴定系统(美国)。

1.2方 法

1.2.1沼液微生物群落碳源代谢活性测定

参考Biolog -Eco 微平板法进行[9]。前三组沼液经充分混匀后，用灭菌的生理盐水(0.89%)稀释2 000倍，水西沟组稀释500倍。分别吸取150 μL 菌悬液接种于生态板的每一个小孔，将接种好Biolog-ECO板放至的25℃的恒温培养箱中培养，并每隔24 h于在Biolog 读数仪上测量590 nm 波长下读取吸光值，连续培养7 d。

1.2.2数据处理方法

微生物群落代谢活性强度采用平均颜色变化率(AWCD)来描述[10]:

AWCD= ∑(Ci-Ro)590/ 31

式中，Ci为每个有培养基孔的吸光值，Ro为对照孔的吸光值，31 为培养基孔数。

采用Simpson(D)、Shannon-Wiener(H’) 和McIntosh(U) 三个指数来表征土壤微生物群落功能多样性。其计算公式如下:

Simpson(D) 指数D= 1-∑pi2

Shannon-Wiener(H’)指数

式中，s为物种总数，pi为第i种物种个体数占群落总个体数的比例。

Ni为抽样中第i个物种的个体数量。

采用Microsoft Excel 2003，DPS 9.50 版软件进行平均吸光值(AWCD) 、多样性指数、主成分( PCA) 分析。

2结果与分析

2.1沼液微生物群落代谢平均颜色变化率

沼液微生物群落单一碳源代谢活性可由平均颜色变化率来直观的反应，微生物群落代谢功能的变化与微生物群落结构相关[11]。平均颜色变化率( AWCD)是判断土壤微生物群落利用碳源能力的重要指标之一，代表土壤微生物的代谢活性[12]。4组沼液样品接种培养后每隔24 h 测定吸光值，消除原始菌浓影响后计算平均吸光值，连续7 d后，得到平均吸光值动态变化图 。可以看出，由于样品稀释浓度较大，多数样品在48 h后，碳源利用强度才开始上升。第1、2、3组样品在培养7 d后，吸光值呈现较大差异，而第4组则趋于相似。曲线快速上升的时间基本都保持在48 h，之后增速放缓，只有第1组7 d后仍保持上扬势头，说明第1组样品微生物群落活性较高。图1～4

图1 额敏沼液AWCD值
Fig. 1AWCD of Emin biogas slurry

图2吐鲁番沼液AWCD值
Fig. 2AWCD of Turpan biogas slurry

图3特克斯沼液AWCD值
Fig. 3AWCD of Tekes biogas slurry

2.2沼液微生物群落代谢多样性指数

依据这4 组样品的碳源利用情况，综合考虑其变化趋势，选取光密度增加较快的第二个拐点96 h 的AWCD 值进行沼液微生物群落代谢多样性的分析。

图4水西沟沼液AWCD值
Fig. 4AWCD of Shuixigou biogas slurry

土壤微生物群落功能多样性以Simpson、Shannon-Wiener和McIntosh 三种指数来表征[12]。其中Simpson 指数(D)用于评估某些最常见种的优势度；Shannon-Wiener 指数(H’)用于评估物种的丰富度；McIntosh 指数(U)用于评估群落物种均匀度。结果表明，水西沟组微生物群落多样性在这4组中相对较高，其中吐鲁番2丰富度指数最高为4.057 6，其他三组中丰富度较高的有额敏4指数为3.993 9，特克斯2指数为3.987 8，特克斯6指数为4.050 6。表2

2.3沼液微生物群落代谢功能主成分分析

根据样品平均颜色变化率曲线，前三组选择培养96 h光密度值来进行主成分分析，水西沟组选择培养48 h光密度值来进行主成分分析及相关性分析。通常取当特征值累积贡献率达80%的主成分个数，以简化原本复杂的多维样本，为保留原始数据中的特征信息，选取方差贡献率最高的前两个主成分PC1和PC2进行主成分分析。

额敏组分析结果为，前3个特征值累积方差贡献率为100%，特征值分别为14.4、12.6和3.94，方差贡献率依次为46.6%、40.6%和12.8%。提取累积方差贡献率为87.2%的前两个主成分PC1和PC2，进行沼液微生物碳源利用主成分分析。结果表明，额敏4在PC1上与其他3个样有较大差异，说明日常勤于维护的与疏于管理的沼液微生物在碳源利用上存在一定的差异。可能与新鲜原料的不断补给有关。图5

表2 沼液微生物多样性指数
Table 2Diversity indices of Biogas slurry microbial

沼液样品Sample平均吸光度AWCD优势度指数Simpson(D)丰富度指数Shannon-Wiener(H’)均匀性指数McIntosh(U)e10.19061.05123.48141.0944e20.44090.97293.76640.941e30.04890.97293.76640.941e40.47340.98633.99390.9684tu10.05171.00413.74591.0087tu20.32910.99854.05760.9965tu30.43710.97543.85980.945tu40.46690.99583.40160.9921tu50.24430.99583.40160.9921TE10.17951.0153.28161.0257TE20.48790.98373.98780.9623TE30.24450.99183.42770.9847TE40.05240.99183.42770.9847TE50.28230.99863.40690.9972TE60.41420.99954.05060.9989s10.42931.01744.37711.0431s20.6811.00894.77071.0262s30.81581.00054.75961.0015

吐鲁番组分析结果为，前4个特征值累积方差贡献率为100%，特征值分别为11、8.9、7.1和3.8，方差贡献率依次为35.5%、28.7%、23.1%和12.7%。提取累积方差贡献率为64.3%的前两个主成分PC1和PC2，进行沼液微生物碳源利用主成分分析。可以看出，吐鲁番2和吐鲁番4两点非常接近，说明这两个样微生物碳源利用水平相似，结合户用沼气基本信息表判断，这连个沼气池停止产气的原因是相似的，微生物碳源利用水平也基本相同。图6

特克斯组分析结果为，前5个特征值累积方差贡献率为100%，特征值分别为11.6、8.1、5.6、4.4和1.3，方差贡献率依次为37.6%、26.1%、18%、14%和4.3%。提取累积方差贡献率为63.7%的前两个主成分PC1和PC2，进行沼液微生物碳源利用主成分分析。可以看出，从PC1和PC2的累积贡献率只有63.7%，只能代表总信息权重的一半多一点，因此图7所显示的信息的参考价值相对更低一些。图7

水西沟组分析结果为，前3个特征值累积方差贡献率为100%，特征值分别为17.6、8.9和4.4，方差贡献率依次为56.9%、28.7%和14.4%。提取累积方差贡献率为85.6%的前两个主成分PC1和PC2，进行沼液微生物碳源利用主成分分析。可见，水西沟1、2,、3号样在PC1上均有较大差异，在PC2上水西沟2和3相似，总体评判，在碳代谢功能菌群结构方面，2、3号样相似而有别于1号样。推测与维护管理情况相关。图8

图5额敏沼液微生物碳源利用主成分分析
Fig. 5 Principal component analysis onsubstrate utilization potential of microbialcommunity of Emin

图6吐鲁番沼液微生物碳源利用主成分分析

Fig. 6Principal component analysis on substrate utilization potential of microbial

community of Turpan

图7特克斯沼液微生物碳源利用主成分分析
Fig. 7 Principal component analysis onsubstrate utilization potential of microbialcommunity of Tekes

图8水西沟沼液微生物碳源利用主成分分析
Fig. 8 Principal component analysis on substrate utilization potential of microbialcommunity of Shuixigou

对 PC1，PC2的得分系数与单一碳源的 AWCD 进行相关性分析，得出 31 种碳源在两个主成分上的载荷值。主成分分析中的载荷因子可反映不同土壤碳代谢的差异,绝对值越大表明该基质的影响越大，由表3可知：表3

额敏组：在PC1 上具有较高载荷值的碳源共有9种(︱r︱﹥0.900)，包括 D-木糖、D-半乳糖醛酸、衣康酸、2-羟苯甲酸、α-D-乳糖、D-纤维二糖、葡萄糖-1-磷酸盐、苯乙基胺、腐胺。在PC2 上具有较高载荷值的碳源有6种(︱r︱﹥0.900)， 包括 D-甘露醇、L-丝氨酸、N-乙酰基-D-葡萄胺、D-葡萄胺酸、D-苹果酸、D,L-α-甘油。

吐鲁番组：在PC1 上具有较高载荷值的碳源有3种(︱r︱﹥0.900)， 包括 D-半乳糖内酯、甘氨酰-L-谷氨酸、α-丁酮酸。在PC2 上有较高载荷值的碳源有2种(︱r︱﹥0.900)，包括 β-甲基D-葡萄糖苷、衣康酸。

特克斯组：在PC1 上具有较高载荷值的碳源有4种(︱r︱﹥0.900) ，包括 D-半乳糖内酯、L-苯基丙氨酸、N-乙酰基-D-葡萄胺、腐胺。在PC2 上有较高载荷值的碳源有1种(︱r︱﹥0.900) ，α-丁酮酸。

水西沟组：在PC1 上具有较高载荷值的碳源有17种(︱r︱﹥0.900) 包括 β-甲基D-葡萄糖苷、L-精氨酸、D-木糖、4-羟基苯甲酸、D-半乳糖醛酸、吐温40、α-环式糊精、I-赤藻糖醇、2-羟苯甲酸、D-甘露醇、L-丝氨酸、肝糖、D-葡萄胺酸、衣康酸、D-纤维二糖、苯乙基胺、α-D-乳糖。在PC2 上有3种较高载荷值的碳源(︱r︱﹥0.900)包括D-半乳糖内酯、甘氨酰-L-谷氨酸、D,L-α-甘油。

从每一组对PC1和PC2贡献率较大的碳源组成上，没有明显的规律性，由此说明每个沼气池的微生物群落结构差异较大，进而呈现出对碳源利用的多态性。

将以上四组合并做整体主成分分析，并以产气情况划分为产气正常组和产气较低组做碳源载荷值分析，分析结果显示，各组样品分散分布无明显规律，在产气正常组PC1上载荷值最高的碳源是D-甘露醇，其次是甘氨酰-L-谷氨酸，再次是 4-羟基苯甲酸。产气较低组PC1上载荷值最高的碳源是α-D-乳糖，其次是D-木糖，再次是L-苏氨酸。

3讨 论

在正常产气的沼液中，存在着种群繁多的微生物，目前针对沼液微生物生态的分析手段主要有：免培养的分子生物学方法和可培养的纯培养方法，都有其自身的优势和局限性，都会遗漏许多重要的沼液微生物学信息，因此无法以某一单一分析技术的研究结果来揭示沼液中微生物群落的全部生态信息。Biolog方法要求的劳动强度、技术含量都较低，只需对Biolog微平板进行无菌接种操作即可，并且可以在较短的时间内检测较大量的样品。该方法在研究微生物群落功能多样性方面很有意义[14]，尤其适合同一样品处理前后的对比分析。

表3沼液不同碳源在PC1 和PC2 上的载荷值
Table 3Correlation analysis of Biogas slurry different carbon source utilization with PC1 and PC2

碳源额敏(Emin)吐鲁番(Turpan)特克斯(Tekes)水西沟(Shuixigou)(Carbonsource)PC1PC2PC1PC2PC1PC2PC1PC2β-甲基D-葡萄糖苷ß-Methyl-D-Glucoside0.7850.61930.30970.9207-0.3317-0.03430.91810.0077D-半乳糖内酯D-GalactonicAcidy-Lactone-0.69330.14870.9919-0.05950.9155-0.27750.31180.9238L-精氨酸L-Arginine-0.24320.76780.34230.86790.77040.57580.97270.229丙酮酸甲脂PyruvicAcidMethylEster-0.7140.64070.5887-0.7210.6434-0.02980.88370.1742D-木糖D-Xylose-0.903-0.4252-0.7757-0.34450.5374-0.43660.9875-0.1558D-半乳糖醛酸D-GalacturonicAcid0.94820.29720.72050.37740.5717-0.3870.94690.0492L-天冬酰胺酸L-Asparagine-0.67540.64970.34050.8270.09050.49840.86820.2691吐温40Tween400.76290.57870.8792-0.38940.26440.81760.9240.111I-赤藻糖醇I-Erythritol0.83130.22690.5493-0.75790.67010.34070.9767-0.2022-羟苯甲酸2-HydroxyBenzoicAcid0.95350.2783-0.66-0.29760.38550.7550.97660.2028L-苯基丙氨酸L-Phenylalanine-0.55410.83230.8567-0.46640.94220.01090.7906-0.5631吐温80Tween80-0.62880.55320.78390.57410.72090.13170.7465-0.5859D-甘露醇D-Mannitol-0.28840.91160.1993-0.40060.2108-0.07580.9336-0.28874-羟基苯甲酸4-HydroxyBenzoicAcid0.80510.13810.3009-0.12550.5192-0.28690.9287-0.1401L-丝氨酸L-Serine0.33320.9260.43990.70880.48940.61980.99150.1173α-环式糊精a-Cyclodextrin-0.58750.54160.7447-0.64290.04590.36690.97080.0749N-乙酰基-D-葡萄胺N-Acetyl-D-Glucosamine-0.11190.9910.71960.15470.95220.18620.8956-0.0968γ-羟基丁酸y-HydroxybutyricAcid-0.61040.711-0.53180.06090.8357-0.54550.4792-0.7744L-苏氨酸L-Threonine-0.41730.86850.3922-0.35140.5722-0.80740.8864-0.3979肝糖Glycogen-0.3194-0.2637-0.0162-0.2575-0.37960.16680.9410.0622D-葡萄胺酸D-GlucosaminicAcid-0.25690.9540.41340.71050.40150.71590.9606-0.0361衣康酸ItaconicAcid0.9130.31410.34330.9059-0.7761-0.34730.95710.2014甘氨酰-L-谷氨酸Glycyl-L-GlutamicAcid-0.4350.86070.93680.11610.79260.60520.30190.9112D-纤维二糖D-Cellobiose0.94330.29210.08550.72770.38960.7550.95830.1203葡萄糖-1-磷酸盐Glucose-1-Phosphate0.9010.42980.12990.60550.6936-0.59660.89690.3528α-丁酮酸a-KetobutyricAcid-0.52090.830.9561-0.13220.38650.91430.6564-0.7542苯乙基胺Phenylethyl-amine0.94560.30780.8381-0.47290.0587-0.73570.92460.1277α-D-乳糖a-D-Lactose0.95880.15490.8166-0.54410.7746-0.58020.9748-0.0064D,L-α-甘油D,L-a-Glycerol0.29920.92670.26670.30020.4621-0.2075-0.25090.9666D-苹果酸D-MalicAcid0.05260.9881-0.06740.34550.7427-0.62490.75330.5858腐胺Putrescine0.95350.2783-0.02980.42850.9078-0.19910.88610.2969

从平均颜色变化率(AWCD)可以看出，各组样品间微生物活性差异显著。多样性分析显示，水西沟组的Shannon指数较高。正常产气的沼液中均有丰富的好氧菌，底物原料越丰富投料量越大的，AWCD值越高，这与徐庆贤等[5]以PCR-DGGE方法，研究表明，沼气池中具有丰富的微生物种群，并在不同发酵层次和发酵时间存在差异性和优势种群的结论相一致。多样性分析结果显示，每组微生物丰富度存在差异，主成分分析及与碳源相关性分析显示各组沼液在PC1和PC2上做出最大贡献率的碳源各不相同，说明微生物群落结构存在较大差异，并导致了不同的代谢功能差异。

4结 论

北疆地区户用沼气微生物群落在碳代谢水平上多样性显著，各组沼液微生物群落有很高的丰富度，各组样品间微生物代谢活性差异显著，但地域性差别不明显。

沼液微生物群落结构多样性影响了代谢功能的多样性及产气的稳定性，结合数据分析结果和户用沼气实地调查情况发现，对沼气池及相关装备的维护保养及原料的及时更新也是影响沼气使用价值的重要因素。

赵家祥在《必然王国与自由王国的含义及其关系》这篇文章中，分析并融合了关于马克思必然王国与自由王国之关系的多种角度的理解，他的观点可以说涵盖了关于马克思自由劳动概念的多种理解路径。分析赵家祥的文章有利于我们对马克思自由王国这个主题进行聚焦，便于澄清马克思的自由劳动概念。赵家祥认为必然王国有两种含义，自由王国也有两种含义。在他看来，必然王国与自由王国既可以是两个不同的人类实践领域，也可以是不同的两个人类历史时期。

研究尝试将Biolog微平板技术，应用于探析沼液微生物多样性方面。另外，由于研究采用Biolog方法还存在着一定的局限性[15]，只能观测到好氧微生物的碳源利用信息，对厌氧微生物菌群未做分析，还需结合一些其他测定微生物多样性的方法来进一步明确微生物群落功能多样性。

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Microbial Community Diversity Analysis of Biogas Slurry from Households in Northern Xinjiang

CHEN Jing，DAI Jin-ping，YANG Xin-ping，Guli Ahmat，Marhaba， FENG Lei

(ResearchInstituteofAppliedMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences, /XinjiangSpecialEnvironmentalMicrobiologyLaboratory,Urumqi, 830091,China)

Abstract：【Objective】 Comparison of the functions of biogas digesters microbial community diversity in the region from different angles of carbon metabolism.【Method】In Northern Xinjiang household biogas as the research object, use the Biolog micro tablet technology, with the DPS data processing software parsing from four different areas of Northern Xinjiang biogas slurry microbial community diversity of carbon metabolism.【Result】From the rate of change from the average color (AWCD) it could be seen that all samples displayed significant difference between microbial activity. The diversity analysis demonstrated that Shannon index in Shuixigou group was higher. Principal component analysis showed that the biogas slurry the carbon source utilization of the microbial community characteristics showed obvious difference. Among them, the main differentiation in PC1 and PC2 carbon source was also different.【Conclusion 】 The data analysis results told us that the microbial community richness was very high, and there were obvious differences, but the regional difference was not obvious.

Key words:biogas slurry; microbial diversity; biolog ecological plate；carbon metabolism

中图分类号：S188

文献标识码：A

文章编号：1001-4330(2016)03-0539-08

作者简介:陈竞(1981-)，男，新疆乌鲁木齐人，硕士研究生，助理研究员,研究方向为生物质能源综合利用,(E-mail)592393697@qq.com通讯作者:冯蕾(1967-)，女，新疆乌鲁木齐人，博士,研究方向为生物能源,(E-mail)fl_xj03@sina.com

基金项目:国家自然科学基金项目(31260016)；新疆维吾尔自治区重大专项(201130104)

收稿日期：2015-09-09

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.03.021

Fund project:Supported by NSFC (31260016) and the special fund for major scientific and technological research of Xinjiang Uygur Autonomous Region (201130104)