羟喜树碱2种固体分散体在SD大鼠口服吸收生物利用度的比较

吴先闯 郝海军 刘瑜新 宋晓勇 张永州 张红芹

[摘要]为了提高羟喜树碱的生物利用度，该研究制备了羟喜树碱固体分散体和羟喜树碱磷脂复合物固体分散体，并评价其溶解度、溶出度。SD大鼠分别灌胃给予羟喜树碱固体分散体和羟喜树碱磷脂复合物固体分散体，取血，以喜树碱为内标，HPLC测定羟喜树碱的血药浓度，并计算药动学参数。结果表明羟喜树碱2种固体分散体的Cmax，AUC0t及AUC0∞与原料药相比都有显著性提高。羟喜树碱固体分散体的AUC0t与原料药的AUC0t相比提高17687%；而羟喜树碱磷脂复合物固体分散体提高27259%。因此，羟喜树碱2种固体分散体可显著性提高羟喜树碱的口服吸收生物利用度，但羟喜树碱磷脂复合物固体分散体效果更优。

[关键词]羟喜树碱；固体分散体；生物利用度

羟基喜树碱（10hydroxycamptothecin， HCPT）是我国特有珙垌科乔木喜树种子中分离提取的一种生物碱，是目前从喜树中分离出20多个单体中抗癌作用最强的化合物。与抗代谢药及烷化剂不同，HCPT可选择性地抑制拓朴异构酶I（topoismerase I， Topo I），从而干扰DNA的复制。且与其他常用的抗肿瘤药无交叉耐药，因此在抗肿瘤方面具有很好的应用前景[1]。但HCPT水溶性、脂溶性均较差，大大限制了其在临床上的应用。目前临床上使用的注射剂采用与氢氧化钠反应成盐使之溶解，但其E环被打开，活性下降。同时注射可能带来感染，血栓形成及药物外渗造成组织坏死等不良反应。目前HCPT研究较多的有纳米粒、脂质纳米粒、纳米微球、纳米脂质体、胶束等注射剂型[14]。对于羟喜树碱需要长期使用的化疗药物，开发口服给药制剂显得意义重大。

固体分散体（solid dispersion， SD）的基本原理是利用水溶性载体将难溶性药物制成固体分散体，以增加难溶性药物的溶解度。该技术可使难溶性药物具有高度分散性并具有高度润湿性，加速药物的溶出，提高吸收速度，从而提高难溶性药物的口服吸收生物利用度。磷脂复合物（phospholipid comple or phytosomes ）系指在非质子传递体系溶剂中，药物与磷脂以一定配比关系结合而形成的复合物[510]。形成磷脂复合物后， 药物的脂溶性与水溶性均可得到明显改善，其亲脂性的改善更为显著[7]。但磷脂复合物疏水性较强，导致其分散性较差。进一步将磷脂复合物制备成固体分散体可改善磷脂复合物的分散性，提高溶出速率，有利于进一步提高药物的生物利用度。本文分别制备了羟喜树碱固体分散体（HCPTSD）及羟喜树碱磷脂复合物固体分散体（HCPTPCSD），并对其理化性质进行了初步研究，进而比较2种固体分散体在体内的药动学及吸收生物利用度，以期为相关研究提供有价值的参考。

1材料

LC10A型高效液相色谱仪；SPD10A型紫外可见检测器（日本岛津公司）；MD2002型氮气吹扫仪（杭州奥威仪器有限公司）；RE52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；BS224S型电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；THZ92A型恒温振荡器（翠柳实验仪器公司）；XW80A型漩涡混合器（上海医科大学仪器厂）；M307098型控温式磁力搅拌器（上海至威电器有限公司）；DZF6050型真空干燥箱（上海跃进医疗器械厂）。

10羟基喜树碱（湖北康宝泰精细化工有限公司，纯度>995%）；大豆卵磷脂（上海艾韦特医药科技有限公司）；聚乙烯吡络烷酮（PVP K30，中国国药集团化学试剂有限公司）；肝素（南京新百药业有限公司）；其余均为分析纯或药用规格。

SD大鼠，雌雄兼用，体重（300±20） g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（沪）20030003。

2方法

21羟喜树碱固体分散体的制备[11]

采用溶剂熔融法制备固体分散体。按质量比1∶15将载体PVP K30在60 ℃下熔融，取羟喜树碱溶解于丙酮中。将羟喜树碱有机溶液加入到熔融状态载体中，搅拌均匀。于60 ℃水浴上继续搅拌除去有机溶剂，残留物置于45 ℃真空干燥24 h，即得羟喜树碱固体分散体。于干燥器中保存，备用。

22羟喜树碱磷脂复合物固体分散体的制备[12]

采用溶剂法制备羟喜树碱磷脂复合物[3]。按摩尔比1∶1将羟喜树碱与磷脂溶解度丙酮中，50 ℃搅拌6 h，减压蒸干，回收有机溶剂。置于45 ℃真空干燥24 h，即得羟喜树碱磷脂复合物。按质量比1∶15将羟喜树碱磷脂复合物与PVP K30溶解于无水乙醇中，于50 ℃搅拌2 h后减压蒸干，回收乙醇。置于45 ℃真空干燥24 h，即得羟喜树碱固体分散体。于干燥器中保存，备用。

23X射线衍射（XRD）分析

HCPT在2种固体分散体中的分散状态用XRD进行分析。扫描条件：铜靶，管压40 kV，管流200 mA，扫描速度为5°/min，扫描范围3～45°。

242种固体分散体溶解度考察

取过量的HCPT，HCPTSD及HCPTPCSD加入到蒸馏水中，25 ℃下按照恒温摇床法平衡24 h。022 μm微孔滤膜过滤，取续滤液适当稀释后，HPLC测定，并计算溶解度。

252种固体分散体体外溶出度考察

分别称取20 mg羟喜树碱，含等量羟喜树碱固体分散体及羟喜树碱磷脂复合物固体分散体，分别置于透析袋中。以含10%SDS的醋酸缓冲液（pH=40）900 mL为释放介质，转速100 r·min-1，温度（37±05） ℃，分别于5，10，20，30，45，60，90 min取5 mL，并同时补同温度、同体积的溶出介质。样品溶液经045 μm微孔滤膜过滤后，取续滤液，测定峰面积并绘制溶出曲线。

26HCPT测定方法的建立

261色谱条件C18色谱柱（46 mm×200 mm， 5 μm）；柱温35 ℃；检测波长为384 nm；流速为10 mL·min-1。对于血浆样品，流动相为甲醇03%醋酸溶液（三乙胺调pH至40） 6∶4；对于其他样品流动相为甲醇01 mol PBS（pH 40） 6∶4，其他条件不变。

262血浆样品处理方法血浆样品解冻后，涡旋混匀，精密吸取100 μL于离心管中，加入内标200 μL，涡旋混匀，加入提取液（正己烷二氯甲烷异丙醇100∶50∶3）3 mL，6 000 r·min-1离心10 min，转移上层有机相于另一离心管中，40 ℃液氮气吹干，残渣用100 μL 流动相复溶，取20 μL 进样HPLC测定。

263对照溶液的配制精密称取羟喜树碱对照品496 mg，置于50 mL量瓶中，乙腈超声溶解，定容至刻度线。分别量取01，02，05，10，20 mL置于25 mL量瓶中，用流动相定容至刻度线，得质量浓度为0396 8，0793 6，1984，3968，7936 mg·L-1的对照品溶液。各浓度分别继续取01 mL置于10 mL量瓶中，得质量浓度为3968，7936，1984，3968，7936 μg·L-1的系列对照溶液，冰箱保存备用。

264内标溶液的制备精密称取喜树碱30 mg，置于100 mL量瓶中，加入一定量的DMSO溶解后乙腈定容至刻度线，摇匀。精密量取10 mL内标储备液置于100 mL量瓶中，乙腈定容至刻度线即得03 mg·L-1的内标溶液。

265标准曲线的制备于100 μL空白大鼠血浆中加入系列对照溶液，并分别加入内标溶液50 μL，按照262项下进行处理，进样测定。记录羟喜树碱峰面积（As）与内标的峰面积（Ai），以As与Ai之比对质量浓度（C）进行线性回归，得回归方程C=20147As/Ai-092，r=0999 0；线性范围3968～7936 μg·L-1。

266日内及日间精密度分别配制低、中、高（3968，1984，7936 μg·L-1）3个质量浓度的血浆样品，按照262方法处理。各浓度在1 d内连续测定5次，得日内精密度。各浓度连续测定5 d，每天1次，得日间精密度。低、中、高浓度日内精密度RSD分别为69%，51%，56%。低、中、高浓度日间精密度RSD分别为90%，67%，52%。

267回收率实验分别配制低、中、高（3968，1984，7936 μg·L-1）3个质量浓度的血浆样品，按照262方法处理。进样分析，计算测定值及回收率。结果显示低、中、高3个质量浓度平均回收率分别为9072%，9204%，9447%。

268血浆样品稳定性试验将含药血浆样品置于-20 ℃冰箱保存，分别于0，5，10，20 d按照262项下处理，并进样测定其浓度。结果显示，浓度波动无统计学意义，表明血浆样品在-20 ℃冰箱保存20 d内稳定。

27大鼠体内药动学研究

271实验方案取SD大鼠18只，随机分为3组，每组6只，实验之前12 h禁食不禁水。分别灌胃给予羟喜树碱原料药混悬液、羟喜树碱固体分散体和羟喜树碱磷脂复合物固体分散体，给药剂量以羟喜树碱计为3 mg·kg-1。分别于0133，025，033，05，075，10，15，20，30，50，80 h眼眶取血06 mL，置于肝素化离心管中，3 000 r·min-1离心3 min，以262项下处理进样测定血药浓度，并绘制血药浓度时间曲线。

272数据分析达峰时间（Tmax）和达峰浓度（Cmax）均采用实测值，药时曲线下面积（AUC0～∞）采用梯形法计算，数据以±s的形式表示。

3结果

31X射线衍射（XRD）分析

结果见图1。HCPT原料药具有明显的晶体衍射，表明HCPT主要以结晶型存在。HCPTSD和HCPTPCSD 2种固体分散体表现出典型的无定型结构峰，HCPT的晶体衍射峰完全消失，说明HCPT以无定形态高度分散在2种固体分散体的载体材料中，使HCPT自身的晶体衍射峰被抑制，从而表现出无定型结构峰，有利于HCPT溶解度的改善及溶出速率的增加。而物理混合物仍有HCPT的晶体衍射峰存在，表明成功制备了不同于物理混合物的HCPTSD和HCPTPCSD 2种固体分散体。

32表观溶解度实验

HCPT 2种固体分散体溶解度结果见表1。由结果可知，HCPTSD和HCPTPCSD的表观溶解度分别为（3021±057），（5723±033）mg·L-1，与HCPT表观溶解度相比都得到极显著性提高

（P<001）。另外，与HCPTSD表观溶解度相比，HCPTPCSD的表观溶解度有显著性提高（P<005），表明将HCPT制备成HCPTPC，并进一步制备成固体分散体后能进一步增加HCPT的表观溶解度。

33体外溶出实验

HCPT 2种固体分散体体外溶出实验结果见图2。结果表明，HCPT 2种固体分散体在50 min左右累积溶出度达到80%以上，而HCPT原料药90 min内累积溶出度仅为2192%。HCPTPCSD的累积溶出度高于HCPTSD，这可能与其表观溶解度高于HCPTSD有关。

34HCPT 2种固体分散体体内药动学研究[12]

将ig给药后的各组大鼠血浆按262项下方法处理，261项下色谱条件检测HCPT的量，并绘

制血药浓度时间曲线，结果见图3，各主要药动学参数见表2。HCPT的2种固体分散体的Cmax，AUC0t，AUC0∞与原料药相比都有显著性提高。Cmax由（2741±455） μg·L-1分别显著性提高到（4276±479），（6316±524） μg·L-1。HCPTSD的AUC0t与原料药相比提高17687%；而HCPTPCSD提高27259%，12 h后仍可检测到少量HCPT。而且HCPTPCSD的AUC0t或AUC0∞与HCPTSD相比具有显著性差异（P<005）。另外，HCPTPCSD的Tmax与HCPT和HCPTSD的Tmax相比有显著性延长。研究结果表明2种固体分散体的制备均有助于增加HCPT的吸收和进入体循环的量，从而提高口服生物利用；而HCPTPCSD与HCPTSD相比在增加HCPT口服吸收生物利用度方面更具优势。

4讨论

HCPT溶解度较差，在水中仅为451 mg·L-1[3]。改善其溶解度及累积溶出度，可提高口服吸收生物利用度。固体分散体技术用于难溶性药物提高药物溶解度及溶出度、提高口服吸收生物利用已受到国内外药学工作者的普遍关注。本研究将HCPT分别制备成HCPTSD及HCPTPCSD后，XRD衍射实验结果显示，HCPT在2种固体分散体中以无定型状态存在，有助于溶解度和累积溶出度的提高。溶解度实验结果显示，HCPTSD和HCPTPCSD的表观溶解度分别为（3021±057），（5723±033） mg·L-1，与HCPT表观溶解度相比都得到极显著性提高（P<001）。体外溶出实验结果表明，2种固体分散体在50 min内累积溶出度达到80%以上，而HCPT原料药90 min内累积溶出度仅为2192%。HCPT溶解度及累积溶出度的改善为提高其口服吸收生物利用奠定了基础。

SD大鼠体内药动学研究结果显示，HCPT的2种固体分散体的Cmax，AUC0t，AUC0∞与原料药相比都有显著性提高。HCPTSD和HCPTPCSD的AUC0t与原料药相比提高17687%，27259%。HCPTPCSD的Tmax与HCPT和HCPTSD的Tmax相比有显著性延长，这可能是因为磷脂复合物增加了HCPT的脂溶性，经胃肠道黏膜上皮细胞时因其较强的脂溶性而暂时滞留于其中，磷脂复合物中的药物则持续缓慢释放入血液循环[6]，因而HCPTPCSD的Tmax有显著性延长。HCPTPCSD的AUC0t或AUC0∞与HCPTSD相比具有显著性增加（P<005）。这可能是因为药物有良好的水溶性，适度的脂溶性才能较好地经黏膜吸收，HCPTSD只增加了HCPT的水溶性；而HCPTPCSD不仅增加了HCPT的脂溶性（磷脂复合物技术），同时也增加了水溶性（固体分散体技术）[12]，因而HCPTPCSD与HCPT SD相比更具有增加口服吸收生物利用度的优势。采用磷脂复合物与固体分散体联用技术为改善一些中药成分生物活性较强而体内吸收较差较差，提高其口服吸收生物利用度提供了新的策略。

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[责任编辑曹阳阳]