野灯心草地上部分菲类成分及其抗焦虑作用研究お

孙璐 付茜 张婵溪 王小红 王勤辉 庞欢欢 江美芳 黄建梅

[摘要]运用正相硅胶、Sephadex LH20、聚酰胺、制备型HPLC等多种色谱方法从野灯心草地上部分分离纯化得到10个菲类化合物和4个其他类化合物。经质谱、NMR谱图解析鉴定结构，分别为厄弗酚（1）、灯心草酚 （2）、juncuenin D （3）、去氢厄弗酚（4）、去氢灯心草酚（5）、juncuenin B （6）、dehydrojuncuenin B（7）、2甲氧基7羟基1甲基5乙烯基菲（8）、2羟基7羧基1甲基5乙烯基9，10二氢菲（9）、2羟基7羧基1甲基5乙烯基菲（10）、木犀草素（11），香草酸（12）、瑞香素（13）、对香豆酸（14）。其中，化合物13为首次从该属植物中分离得到，化合物5，8～12为首次从该植物中分离得到。采用小鼠高架十字迷宫实验评价菲类化合物6和7的抗焦虑活性，结果表明化合物6和7均具有抗焦虑作用。

[关键词]野灯心草；菲类成分；高架十字迷宫；抗焦虑作用

野灯心草Juncus setchuensis Buchen为灯心草科灯心草属植物，主要分布于我国西南地区，生长在海拔800～1 700 m的山沟、林下湿地、道路溪旁浅水处[1]。野灯心草具有与灯心草类似的功效，能利水通淋，泄热安神，主治热淋，肾炎水肿，心热烦躁，心悸失眠等症，其入药部位为根、根茎或全草[2]。目前已从野灯心草中分离鉴定出菲类、黄酮类、丹参酮类、生物碱类、有机酸类等成分[35]。本课题组前期研究表明，灯心草中所含的菲类成分具有抗焦虑活性，为其功效清心除烦的物质基础[68]，为深入研究灯心草属植物菲类成分抗焦虑作用的构效关系，本实验对野灯心草地上部分菲类成分进行研究，从中共分离得到10个菲类化合物和4个其他类化合物，并对分离得到的菲类成分进行抗焦虑活性评价。

1材料

柱色谱硅胶（80～100目，200～300目，300～400目），柱色谱聚酰胺（60～80目）和薄层色谱硅胶G板均为青岛海洋化工厂生产；Sephadex LH20购于Pharmacia公司；显色剂为10%浓硫酸的乙醇溶液（自制），其余试剂均为分析纯；地西泮，纯度>97%，批号880801，江西第四制药厂；羧甲基纤维素钠，分析纯，批号011220，北京市旭东化工厂。

IsolearOne快速制备色谱（biotage公司）；ZF20D 型暗箱式紫外分析仪（上海宝山顾村电光仪器厂）；Avance 500核磁共振仪（Bruker AG）；LC20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Thermo BDS HYPERSIL C18柱（10 mm×250 mm，5 μm）；Thermo Fisher Scientific TSQ Quantum 三重四级杆液质联用仪（赛默飞世尔科技有限公司）；Xevo G2S QTof液质联用仪（沃特斯公司）；Sartorius精密电子天平（德国赛多利斯公司）。

野灯心草J setchuensis于2013年12月采自福建武夷山，经中国科学院植物所标本室林祁教授鉴定。

SPF级KM小鼠，雄性，体重（20±2） g，购于北京斯贝福实验动物科技有限公司（SCXK（京）20110004）。

2提取与分离

9 kg野灯心草（福建武夷山）地上部分，切小段（约3 cm），粉碎，以15倍量80%乙醇回流提取2次，合并提取液，浓缩，真空干燥，得到乙醇提取物148 kg。经硅胶（80～100目）拌样，石油醚、乙酸乙酯、甲醇分别洗脱，得到乙酸乙酯部位浸膏69 g。利用快速制备色谱对乙酸乙酯部位进行分离。快速制备色谱条件为SNAP 340 biogage色谱柱，流动相为石油醚（A）醋酸乙酯（B），梯度洗脱0～15（柱体积，CV），16%B；15～8 CV，37% B；流速80 mL·min-1，检测波长254，270 nm，菲类成分在检测波长处有紫外吸收，得到3个组分F1～F3。

将F2组分125 g进行硅胶柱色谱分离，以石油醚醋酸乙酯（5∶2）进行洗脱，得到8个子流分（F201～F208）。组分F204经硅胶柱（二氯甲烷甲醇2∶001）分离，得到6个组分F2041～F2046。F2043先以硅胶柱（正己烷丙酮5∶15）分离得到组分F20433，经硅胶柱（二氯甲烷甲醇10∶002）纯化得到化合物2（100 mg）；组分F2042用Sephadex LH20（甲醇）分离纯化，得到化合物8（3 mg）。组分F205经硅胶柱分离（环己烷二氯甲烷醋酸乙酯5∶1∶1）得到7个组分F2051～F2057，F2054经硅胶柱分离（二氯甲烷甲醇5∶001）得到组分F20543和F20544，分别经硅胶柱（二氯甲烷甲醇5∶008和石油醚丙酮5∶1）分离，得到化合物1（71 mg）、化合物5（11 mg）；F2056经聚酰胺柱色谱分离（60%甲醇）和Sephadex LH20（100%甲醇）纯化，得到化合物6（100 mg）。组分F206经硅胶柱（环己烷二氯甲烷醋酸乙酯5∶1∶2）分离，得到组分F2063，经硅胶柱（二氯甲烷甲醇10∶007）多次分离，得到化合物4（15 mg）。组分F207经硅胶柱色谱（环己烷二氯甲烷醋酸乙酯5∶1∶2）分离得到F2073与F2075，F2073经硅胶柱（二氯甲烷甲醇10∶025）和Sephadex LH20（100%甲醇）分离纯化，得到化合物7（4 mg）；组分F2075直接由Sephadex LH20（100%甲醇）分离得化合物3（1 mg）。

组分F3经硅胶柱分离（二氯甲烷甲醇10∶025）得到8个组分F301F308，其中F306在甲醇中析出棕色方块状结晶，为化合物14（41 mg）。F304经硅胶柱分离（环己烷丙酮醋酸5∶15∶01）得到组分F3044和F3045，F3044用硅胶柱（二氯甲烷甲醇醋酸10∶004∶01）分离后，经制备HPLC[甲醇水（001%甲酸）]分离纯化得到9（2 mg），10（1 mg）；F3045经硅胶柱分离（二氯甲烷甲醇醋酸10∶005∶01）得化合物12（52 mg）；F305经硅胶柱分离（二氯甲烷甲醇10∶025）得到组分F3054和F3055，F3054经Sephadex LH20（100%甲醇）分离，得到化合物13（7 mg）；F3055经硅胶柱多次分离（二氯甲烷甲醇醋酸10∶03∶01）得到化合物11（9 mg）。

3结构鉴定

化合物1淡黄色结晶（甲醇），HRESIMS m/z 251114 28[M-H]-， 1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 720（1H，d，J=82 Hz，H4），665（1H，d，J=85 Hz，H3），686（1H，d，J=20 Hz，H6），666（1H，d，J=20 Hz，H8），694（1H，dd，J=110，170 Hz，H12），565（1H，dd，J=174，1 Hz，H13），521（1H，dd，J=110，10 Hz，H13），266（4H，m，H9，10），222（3H，s，H11）。化合物1的波谱数据与文献[9]中报道一致，鉴定为厄弗酚。

化合物2深黄色结晶（甲醇），HRESIMS m/z 265130 58[M-H]-，1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ：741（1H，d，J=84 Hz，H4），658（1H，d，J=84 Hz，H3），664（1H，s，H8），679（1H，dd，J=179，115 Hz，H12），545（1H，dd，J=114，20 Hz，H13），516（1H，dd，J=181，2 Hz，H13），261（4H，m，H9，10），223（3H，s，H11），219（3H，s，H14）。化合物2的波谱数据与文献[9]中报道一致，鉴定为灯心草酚。

化合物3黄色粉末（甲醇），1HNMR（DMSOd6，500 MHz） δ： 738（1H，d，J=85 Hz，H4），676（1H，d，J=85 Hz，H 3），670（1H，dd，J=181，119 Hz，H12），578（1H，dd，J=119，21 Hz，H13），570（1H，dd，J=181，21 Hz，H13），633（1H，s，H5），283（4H，m，H9，10），970（1H，br s，OH），554（1H，br s，OH），202（3H，s，H11），193（3H，s，H12）。化合物3的波谱数据与文献[10]中报道一致，鉴定为juncuenin D。

化合物4黄色粉末（甲醇），HRESIMS m/z 249100 56[M-H]-，1HNMR（CD3COCD3，500 MHz） δ： 851（1H，d，J=91 Hz，H4），791（1H，d，J=92 Hz，H10），766（1H，d，J=92 Hz，H9），727（1H，d，J=25 Hz，H6），723（1H，d，J=25 Hz，H8），722（1H，d，J =92，H3），749（1H，dd，J=173，107 Hz，H12），576（1H，dd，J= 172，15 Hz，H13），545（1H，dd，J=108，15 Hz，H13），259（3H，s，H11）。化合物4的波谱数据与文献[11]中报道一致，鉴定为去氢厄弗酚。

化合物5深黄色结晶（甲醇），HRESIMS m/z 263114 43[M-H]-，1HNMR（CD3COCD3，500 MHz） δ： 889（1H，d，J=95 Hz，H4），712（1H，d，J =90，H3），784（1H，d，J=90 Hz，H10），758（1H，d，J=90 Hz，H9），727（1H，s，H8），735（1H，dd，J=180，110 Hz，H12），576（1H，dd，J=100，15 Hz，H13），545（1H，dd，J=180，15 Hz，H13），256（3H，s，H11），242（3H，s，H14）。化合物5的波谱数据与文献[12] 中报道一致，鉴定为去氢灯心草酚。

化合物6白色结晶（甲醇），HRESIMS m/z 265130 58[M-H]-，1HNMR（CD3OD，500 MHz）δ： 735（1H，d，J=83 Hz，H4），705（1H，s，H5），671（1H，d，J=80 Hz，H3），678（1H，dd，J=178，115 Hz，H12），558（1H，d，J=113 Hz，H13），515（1H，d，J=179 Hz，H13），271（4H，m，H9，10），218（3H，s，H11），217（3H，s，H14）。13CNMR（CD3OD，125MHz） δ：1564（C2），1554（C6），1395（C1a），1388（C8），1371（C12），1356（C5α），1285（C8α），1263（C4α），1231（C4），1223（C1），1216（C7），1203（C13），1141（C3），1100（C5），272（C10），269（C9），134（C11），119（C14）。化合物6的波谱数据与文献[10]中报道一致，鉴定为juncuenin B。

化合物7淡黄色片状晶体（甲醇），HRESIMS m/z 263114 43[M-H]-，1HNMR（CD3COCD3，500 MHz） δ： 829（1H，d，J=89 Hz，H4），803（1H，s，H5），797（1H，d，J=95 Hz，H10），772（1H，d，J=95 Hz，H9），724（1H，d，J=90 Hz，H3），713（1H，dd，J=179，114 Hz，H12），582（1H，dd，J=114，20 Hz，H13），539（1H，dd，J=179，20 Hz，H13），255（3H，s，H11），238（3H，s，H14）。化合物7的波谱数据与文献[10]中报道一致，鉴定为dehydrojuncuenin B

化合物8深黄色粉末（甲醇），1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 863（1H，d，J=75 Hz，H4），788（1H，d，J=75 Hz，H10），756（1H，d，J=80 Hz，H9），723（1H，d，J=80 Hz，H3），717（1H，s，H6），716（1H，s，H8），745（1H，dd，J=145，90 Hz，H12），575（1H，d，J=140 Hz，H13），543（1H，d，J=90 Hz，H13），259（3H，s，CH3），396（3H，s，OCH3）。化合物8的波谱数据与文献[8]中报道一致，鉴定为2甲氧基7羟基1甲基5乙烯基菲。

化合物9淡黄色粉末（甲醇），HRESIMS m/z 279103 25[M-H]-，1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 808（1H，s，H8），782（1H，s，H6），739（1H，d，J=85 Hz，H4），672（1H，d，J=85 Hz，H3），699（1H，dd，J=175，110 Hz，H12），579（1H，d，J=175 Hz，H13），532（1H，d，J=110 Hz，H13），277（4H，s，H9，10），225（3H，s，CH3）。13CNMR（CD3OD，125 MHz） δ： 1675（COOH），1565（C2），1412（C5α），1396（C1α），1395（C8α），1395（C12），1355（C5），1291（C8），1290（C4），1287（C7），1281（C4α），1255（C6），1220（C1），1142（C12），1122（C3），295（C9），256（C10），119（C11）。化合物9的波谱数据与文献[9]中报道一致，鉴定为2羟基7羧基1甲基5乙烯基9，10二氢菲。

化合物10淡黄色粉末（甲醇），HRESIMS m/z 277085 68[M-H]-，1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 869（1H，d，J=90 Hz，H4），718（1H，d，J=90 Hz，H3），849（1H，s，H8），819（1H，s，H6），802（1H，d，J=90 Hz，H10），782（1H，d，J=95 Hz，H9），751（1H，dd，J=170，105 Hz，H12），587（1H，d，J=170 Hz，H13），552（1H，d，J=105Hz，H13），260（3H，s，CH3）。化合物10的波谱数据与文献[13]中报道一致，鉴定为2羟基7羧基1甲基5乙烯基菲。

化合物11深黄色粉末（甲醇）， 1HNMR（DMSOd6，500 MHz） δ： 1300（1H，s，OH5），741（1H，d，J=20 Hz，H6′），740（1H，d，J=20 Hz，H2′），689（1H，d，J=80 Hz，H5′），668（1H，s，H8），645（1H，s，H3），619（1H，s，H6）。化合物11的波谱数据与文献[14]中报道一致，鉴定为木犀草素。

化合物12白色针状结晶（甲醇），ESIMS m/z 167[M-H]-；1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 758（1H，s，H6），757（1H，d，J=75 Hz，H2），685（1H，d，J=80 Hz，H5），391（s，3H，OCH3）。化合物12的波谱数据与文献[15]中报道一致，鉴定为香草酸。

化合物13灰白色结晶（甲醇），ESIMS m/z 177[M-H]-；1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 783（1H，d，J=95 Hz，H4），618（1H，d，J=95 Hz，H3），700（1H，d，J=85 Hz，H5），682（1H，d，J=85 Hz，H6）。13CNMR（CD3OD，125 MHz） δ： 1620（C2），1497（C7），1453（C4），1435（C9），1321（C8），1188（C5），1125（C6），1123（C10），1108（C3）。化合物13的波谱数据与文献[16]中报道一致，鉴定为瑞香素。

化合物14棕色方块结晶（甲醇），ESIMS m/z 163[M-H]- ；1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ： 749（1H，d，J=160 Hz，Hβ），621（1H，d，J=160 Hz，Hα），742（2H，d，J=85 Hz，H2，6），679（2H，d，J=85 Hz，H3，5）。化合物14波谱数据与文献[17]中报道一致，鉴定为对香豆酸。

4抗焦虑作用评价

41动物分组小鼠随机分为空白组（05% CMCNa）、阳性对照组（地西泮 05 mg·kg-1）、药物高（20 mg·kg-1）、中（10 mg·kg-1）、低（5 mg·kg-1）剂量组，每组10只。灌胃给药，给药量为001 mL·g-1。

42药物配制阳性药配制方法为取10 mg地西泮加入10 mL 05% CMCNa，配制成质量浓度为01 g·L-1的地西泮溶液。

药物配制方法：配制方法同阳性药，配制成质量浓度分别为2，1，05 g·L-1的药物溶液。

43小鼠高架十字迷宫实验小鼠于给药30 min后进行高架十字迷宫实验，将小鼠头朝向开放臂放入高架十字迷宫的中央平台中，同时开始计时，记录小鼠6 min内在高架十字迷宫上的行为。以小鼠进入开放臂的次数（open arm entry，OE）和在开放臂的停留时间（open arm time，OT）为指标，小鼠前后足均进入到臂内为本次进入活动开始，中途任一前足或后足从该臂中完全退出则为该次进入活动结束。

44数据处理计量资料用±s表示，采用统计软件SPSS 170对数据进行分析，统计方法采用单因素方差分析。

45实验结果与空白组比较，阳性对照组（地西泮1 mg·kg-1）、juncuenin B低剂量组（5 mg·kg-1）、中剂量组（10 mg·kg-1）、高剂量组（20 mg·kg-1）小鼠进入开放臂次数（OE）和停留时间（OT）均有所增加。其中juncuenin B 低剂量和中剂量对增加小鼠在开放臂停留时间作用较为显著（P<001），而高剂量组与空白组比较无统计学意义。在增加小鼠进入开放臂次数方面，高、中、低剂量组与空白组相比均无统计学意义。结果表明，juncuenin B 具有抗焦虑作用，其有效剂量为5，10 mg·kg-1。结果见表1。

与空白组比较，阳性对照组（地西泮1 mg·kg-1）、dehydrojuncuenin B低剂量组（5 mg·kg-1）、中剂量组（10 mg·kg-1）、高剂量组（20 mg·kg-1）小鼠进入开放臂次数（OE）和停留时间（OT）均有所增加。但是，对小鼠在开放臂停留时间的影响，只有中剂量组（10 mg·kg-1）和高剂量组（20 mg·kg-1）与空白组比较具有统计学意义（P<005）。Dehydrojuncuenin B高、中、低剂量对小鼠进入开放臂次数的影响与空白组比较均无统计学意义。结果表明，dehydrojuncuenin B具有抗焦虑作用，其有效剂量为10，20 mg·kg-1。结果见表2。

5讨论

菲类化合物是灯心草属植物主要成分，多为中等极性，易溶于醋酸乙酯、乙醇及甲醇等溶剂，主要分布于药材80%乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位中，因此本实验针对野灯心草地上部分醋酸乙酯部位进行分离。由于灯心草属菲类化合物多具有乙烯基，在1HNMR谱图上有苯环氢和乙烯基氢的特征信号，可利用NMR法对含有菲类化合物的组分进行跟踪分离。同时，研究发现灯心草主要含有厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚及去氢灯心草酚，其中以厄弗酚和去氢厄弗酚含量居多；野灯心草除含有上述4个菲类成分外，还主要含有juncuenin B 和dehydrojuncuenin B，其中dehydrojuncuenin B 含量较大。

本课题组前期已证实厄弗酚、去氢厄弗酚、灯心草酚，2甲氧基7羟基1甲基5乙烯基菲具有较强的抗焦虑活性[78，18]。本实验证实了juncuenin B和 dehydrojuncuenin B 也具有抗焦虑作用。研究结果显示，6个菲类化合物抗焦虑作用的剂量略有差别，厄弗酚、去氢厄弗酚和灯心草酚在25 mg·kg-1 剂量下即可产生抗焦虑作用；2甲氧基7羟基1甲基5乙烯基菲、juncuenin B 及dehydrojuncuenin B 在10 mg·kg-1剂量下，均表现出抗焦虑活性。该发现为深入研究灯心草属植物菲类成分抗焦虑作用的构效关系奠定基础，为进一步研究和开发灯心草属植物菲类成分提供了科学依据。

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[责任编辑丁广治]