从补阳还五缓释片体外释放特征窥中药制剂超分子印迹模板お

杨岩涛 吴春英 刘文龙 石继连 周晋 贺福元

[摘要]该研究考察了自制补阳还五单室渗透泵缓释片的体外释放情况，采用总量统计矩原理对其段带相似度进行计算，并对其体外释放特征进行分析以探讨中药制剂超分子印迹模板的存在。结果表明，中药中不同结构的多成分可能存在共同的印迹模板，渗透泵原理制备的补阳还五缓释片中多数成分能够达到“整体受控、同步释放”的目的，但应进一步探讨中药复方中的超分子印迹模板，尝试通过印迹模板控制不同成分的整体同步释放，寻求更适合于中药多成分的控缓释制剂制备技术，使之符合中药用药特点。

[关键词]补阳还五；超分子；印迹模板；缓释；整体受控

前期作者制备了补阳还五缓释片，以渗透泵原理控制中药多成分整体释放[1]，证实了口服渗透泵片制剂以其独特的释药方式和平稳的释药速度成为了控缓释制剂的有效形式。然而对于多种成分的释药过程，尤其是对于复杂的中药复方控缓释制剂而言，渗透泵片制剂亦难以完全满足契合中药多成分控缓释制剂要求的“整体受控，同步释药”的要求。而在本课题组前期研究中发现，人体与中药均为复杂的生物超分子体系[2]，具有与人体分子通道结构相同“印迹模板”的中药分子应是构成中药有效成分的主体，中药有效成分与经络脏腑的印迹作用便形成了中药的药性理论与功效[3]。根据此猜想，在控缓释制剂中，具有相同分子印迹模板的药物成分释放行为应较为接近，亦可根据“印迹模板”的相关理论和技术来实现对中药多成分的整体控制释放，以印迹模板控制药物释放，避免外界因素带来的影响，实现中药缓控释制剂各有效成分整体受控、按一定的构成比同步释放，符合中药用药的特点。

补阳还五汤为中医经典名方，首载于清代王清任《医林改错》，由黄芪、当归、芍药、川芎、桃仁、红花、地龙组成，具补气、通络之功，其在抗血栓、抗衰老、抗脑栓血、抗血脂及调节免疫功能方面有预防和治疗的作用。该方疗效确切，有一定安全性，胃肠道有较好吸收，其适用患者多服药困难，适宜制成控缓释制剂，并且该方成分复杂，对中药复方具有显著的代表性，笔者前期亦自制了补阳还五渗透泵缓释片，并对其体外释放行为进行了研究[1]，得出了采用渗透泵缓释制剂原理制备的补阳还五缓释片多成分溶出能基本达到“整体受控、同步释放”的目的，但前述研究仅仅是建立在宏观释放情况相似度的计算结果上的，表述未尽全面，因此尝试采用段带总量统计矩相似度的方法对之进行分析，期望以制剂中成分释放特征来窥探中药制剂超分子印迹模板规律，以期寻找以“印迹模板”受控理论来实现不同成分而同“印迹模板”的控制释放过程，为中药复方控缓释制剂的研究提供支撑。

1基本原理

11超分子印迹模板理论

超分子印迹模板的概念来源于Fischer的酶与底物作用的“锁与钥匙模型”以及Pauling提出的抗体形成学说，类似于药理学经典的受体配体理论，可以用来解释受体配体理论。但二者又有不同，印迹模板是指以某一特定的目标分子为模板，寻找制备对该分子有特异选择性聚合物的过程，属于超分子化学范畴，同样具有自组织、自组装、自识别与自复制的特点[45]。超分子“印迹模板”概念是化学上的分子结构概念，是“在空间结构和结合位点上能完全匹配的模板物”，对中药成分来说既是其分子结构的空间结构，也可以说是活性原子团的空间排列点阵，能从化学物质的本源上说明主客体分子（在一定程度下是受体配体理论）的普遍作用规律。目前已有将印迹模板技术用于药物分离过程，因此如能根据药物成分的释放行为寻找到不同药物成分的共同印迹模板，探索在中药复方中具有相同印迹模板的成分群，尝试采用超分子印迹模板理论指导中药复方控缓释制剂的制备，实现多成分“整体受控”的目标。

12段带总量统计矩相似度理论

将统计矩原理用于色谱学分析，建立了总量统计矩分析法，可获得中药指纹图谱的总量零阶矩（AUC）、总量一阶矩（MCRT）、总量二阶矩（VCRT）及总响应率（AUCPW）等一系列总量统计矩参数。结合总量统计矩的加和性[6]，可将整张指纹图谱按照一定的方式进行段带，计算出每一段带的总量统计矩参数，可反映出在某一段出峰时间内的成分指纹图谱信息，再将2个指纹图谱相应段带的总量统计矩参数转变成2个正态分布曲线，并定义相似度为2个指纹图谱的正态曲线下重叠面积之和[7]。

总量统计矩相似度法先将指纹图谱曲线函数整合为正态分布函数，再对之进行相似度计算，其值为0～1，体现了单成分特征峰与指纹图谱的随机性，又体现了经总量统计矩整合后的整体性，是指纹图谱特征性与模糊性的统一，且具有加合性与偶联性。

2材料与方法

21材料

Waters公司的高效液相色谱仪，Breeze工作站，Waters 2487 Dual Absorbance Detector，ZRS6智能溶出仪（天津大学无线电厂）， BY300小型包衣机（上海黄海药检仪器厂），重型单冲压片机（上海远东制药机械总厂），乙腈为进口色谱纯，蒸馏水为二次重蒸馏水，醋酸纤维素、聚乙二醇、乙醇等其他试剂均为分析纯。

补阳还五汤复方药材——黄芪、当归、川芎、红花、赤芍、桃仁及地龙均购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科，经湖南中医药大学刘塔斯教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus （Fisch） Bge var monghokicus （Bge） Hsiao 干燥根，伞形科植物当归Angelica sinensis （Oliv） Diels的干燥根，伞形科植物川芎Iigusticum chuanxiong Hort的干燥根，菊科植物红花Carthamus tinctorius L的干燥花，毛莨科植物芍药Paeonia lactlora Pall的干燥根茎，蔷薇科植物桃Prunus persica （L）Batsch的干燥成熟种子，环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum （E perrier）的干燥主体。处方：黄芪60 g，当归9 g，川芎6 g，赤芍9 g，桃仁9 g，红花9 g，地龙9 g。

22色谱条件

Ultimate XBC18柱（46 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）水（含1%乙酸，B），梯度洗脱（0～10 min，0% A；10～25 min，7% A；25～35 min，125% A；35～45 min，18% A；45～55 min，25% A；55～65 min，30% A；65～70 min，325% A；70～71 min，37% A；71～80 min，40% A；80～100 min，80% A；100～115 min，100% A；115～120 min，0% A），流速1 mL·min-1，UV 检测264 nm，柱温40 ℃。

23补阳还五缓释片及待测样品的制备

补阳还五缓释片的制备：取补阳还五汤原方，加8倍量水煎煮l h，共2次，合并煎煮液并将之浓缩至约1∶1，加乙醇醇沉2次，每次静置24 h，过滤。滤液回收乙醇至净，浓缩至流浸膏，加入适量淀粉和糊精，混匀，60 ℃通风干燥至全干，取出粉碎制得补阳还五全方药粉，备用。

取已制备补阳还五汤全方药粉，加入适量微晶纤维素，以及适量氯化钠作为促渗剂，喷洒适量95%乙醇，10 目筛制粒，置于干燥箱内于60 ℃通风干燥15 h后，用14目筛整粒，使细粉含量不超过20%，压片。

配制约30 g·L-1的醋酸纤维素丙酮溶液，加入适量PEG6000作为致孔剂，取已压制片芯，喷雾包衣，在已包衣的片剂两侧分别打孔，制得补阳还五渗透泵缓释片。

待测样品溶液的制备：取补阳还五缓释片，照释放度测定法（《中国药典》2005年版二部附录XD第一法），采用溶出度测定法（《中国药典》2010年版二部附录XC）第三法装置，以01 mol·L-1的盐酸溶液250 mL为溶出介质，转速为100 r·min-1，温度370 ℃，依法操作并分别在1，3，5，7，9 h时取样，每次取样5 mL，同时补充等温等体积的溶出介质，所取样品于60 ℃真空干燥，挥干溶剂，加05 mL甲醇溶解，过045 μm微孔滤膜即得待测样品。

3结果与分析

31补阳还五渗透泵缓释片体外溶出指纹图谱的建立及其积分条件的确定

311指纹图谱积分条件的确定精密吸取甲醇溶液5 μL，进样测得空白图谱，以仪器最小的积分门槛值进行积分得空白甲醇参数，再考虑进行梯度洗脱时，洗脱剂的比例改变及甲醇杂志产生的稳定的空白对照峰，提高最小峰面积再次进行积分，根据噪音峰的平均峰宽、平均响应率、平均最小峰面积、平均最小峰高以及信噪比为3倍[8]，结合总量统计矩加合原理[6]确定该指纹图谱的积分阈值：峰宽、响应率、面积总量和峰高分别为26 s，45 V·s-1，360 μV·s，20 μV。

312补阳还五渗透泵缓释片体外溶出指纹图谱取自制补阳还五缓释片按23项下释放度测定方法进行释放度测定分别制得释放1，3，5，7，9 h样品，按22项下方法各取样5 μL进样制备指纹图谱S2～S6，空白甲醇样品指纹图谱S1，见图1。

32补阳还五缓释片释放特征分析

分别对指纹图谱S2～S6按前述积分条件积分，积分后输出数据，见表1。

对表1数据进行分段，按10 min为段采用总量统计矩相似度法分别计算释放时间1，3，5，7 h与释放9 h的指纹图谱即S6之间的相似度，共计11段，其相似度结果见表2。

由相似度可以看出，在补阳还五渗透泵缓释片中复方补阳还五药物中大多数成分能实现整体受控，随着释放时间的延长，指纹图谱相似度逐渐逼近，但也可看出，在指纹图谱不同出峰时间即不同成分的释药阶段并不完全雷同，出峰时间除20～30，30～40，70～80 min 3段外，其余各段7 h与9 h相似度均接近于1，说明这些成分在7 h内即基本释放完毕，而出峰时间在这3段的成分则在7～9 h仍有释放；出峰时间在50～60 min的成分在1 h内有快速释放，然后又缓慢释放；而出峰时间在60～70，90～100，100～110 min的成分则在1 h内既已基本完全释放，即渗透泵片对这一部分成分的控缓释效果不好，如果这些成分是补阳还五汤的有效成分，则需对之采用另外的方法进行控制；出峰时间在20～30 min的成分则在1 h内较少释放，而在3～5 h

释放量较大；其余各段出峰时间的成分则基本在稳定释放，在一定程度上达到了控释且整体同步受控的效果。

4讨论

本研究对自制补阳还五渗透泵缓释片体外释放情况进行了考察，对其不同释放时间样品指纹图谱按出峰时间进行分段，采取总量统计矩原理计算其段带相似度，从指纹图谱数据及计算获得的相似度数据可以看出，采取渗透泵原理制备的补阳还五缓释片中多数成分能够实现“整体受控、同步释放”的目的，一定程度上使之符合中药用药的特点，能够顺应中药多成分群药物动力学行为调整的需要，但也可看出由于渗透泵片依赖渗透压控制的原理，药物的释放并不能够完全切合中药复方用药之精髓，仍需进一步探求适合于中药多成分的控缓释制剂制备技术。当然，补阳还五汤物质基础尚未完全明确，前期大量研究表明[910]总苷、总苷元、总多糖、总生物碱为其主要活性成分，本研究自制补阳还五渗透泵缓释片的主要目的系考察制剂中成分释放的整体同步性，仍有较多制剂学的细节问题未纳入本研究的探讨范围，需在后续研究中进一步探讨。

再则，结合液相色谱原理及相似度评价结果，出峰时间接近的药物具有相接近的释药行为，这符合了结构相近可以具有相同的印迹模板的传统理念。然而出峰时间在60～70，90～100 min的成分也具有相近的释药行为，这也能够切合成分结构不同，但如具有相同的印迹模板亦可呈现相同或相近的理化性质及药理作用，这在大量使用的化学药中也已得到证实：如吗啡、芬太尼及亮氨酸脑啡肽等结构大不相同，但由于具有相同的印迹模板而具有相同的镇痛作用，此外中药复方在煎煮过程及从制剂中释放的过程中均有表现出自组织、自组装、自识别与自复制的明显的超分子作用特征，同一中药不同成分或不同中药不同成分，在体内能自组织、自组装、自复制成超分子，能自识别作用于与“印迹模板”相一致的经络脏腑靶区产生药效，因此在中药控缓释制剂研究过程中，如能认识中药复方中的超分子印迹模板，将能通过印迹模板来控制不同成分的同步释放，从而摆脱目前中药多成分控缓释制剂仍在借助单成分制剂制备技术，无法真正契合中药复方用药特点的现状，开拓出适合于中药多成分的控缓释制剂制备技术。

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[责任编辑孔晶晶]