ADSCs和β-TCP复合支架制备及其对猪膝关节软骨缺损组织CollagenⅡ、Sox-9表达的影响

王宇，王琪，杜明昌，刘铭，刘欣伟，张玉彪，刘松波，刘宪民，项良碧

(沈阳军区总医院，沈阳110016)

·论著·

ADSCs和β-TCP复合支架制备及其对猪膝关节软骨缺损组织CollagenⅡ、Sox-9表达的影响

王宇，王琪，杜明昌，刘铭，刘欣伟，张玉彪，刘松波，刘宪民，项良碧

(沈阳军区总医院，沈阳110016)

目的 制备猪脂肪干细胞(ADSCs)和β-磷酸三钙(β-TCP)复合支架，观察其对猪膝关节软骨缺损组织CollagenⅡ和Sox-9表达的影响。方法 取1只巴马小型仔猪的颈部皮下脂肪组织，分离并鉴定ADSCs。以β-TCP作为支架材料，将其制成12个圆柱体支架，随机选择其中6个进行成骨诱导。将12个支架与ADSCs复合培养，制备复合支架，对经成骨诱导后复合支架上的ADSCs进行茜素红和碱性磷酸酶染色。将18只巴马小型猪随机分为空白对照组、支架组、成骨诱导支架组，每组6只。支架组、成骨诱导支架组制备与支架大小相符的膝关节软骨缺损模型，并分别植入未经过、经过成骨诱导的复合支架；空白对照组切开膝关节后直接缝合，不进行其他处理。各组常规饲养4周后处死，取缺损处软骨组织，采用荧光定量PCR法检测CollagenⅡ mRNA和Sox-9 mRNA相对表达量，Western blotting法检测CollagenⅡ蛋白和Sox-9蛋白相对表达量。结果 分离提取的ADSCs在分离初期镜下显示为圆形单个细胞，细胞的边缘比较清楚，细胞贴壁并形成均匀分布的细胞。免疫组化染色显示，分离的细胞CD44和CD105表达均为阳性，证明其为ADSCs。与空白对照组比较，支架组和成骨诱导支架组软骨组织CollagenⅡ和Sox-9 mRNA及蛋白相对表达量均降低，但支架组降低更明显(P均<0.05)。结论 成功制备了ADSCs和β-TCP的复合支架；该支架经成骨诱导后可提高猪膝关节软骨缺损组织CollagenⅡ和Sox-9的表达。

软骨缺损；膝关节；软骨下骨；β-磷酸三钙；脂肪干细胞；复合支架；猪

脂肪干细胞(ADSCs)是来源于脂肪组织中的具有多向分化潜能的成体干细胞。研究表明，ADSCs与骨髓基质干细胞(BMSCs)具有相同的干细胞特征，包括不断的自我更新和多向分化潜能[1,2]。ADSCs具有全身分布广泛、容易获取、对机体损伤小以及容易为患者所接受等特点，已成为近年来干细胞研究的热点之一，逐渐成为组织工程种子细胞的新来源[3]。2013年7月～2015年9月，本研究制备猪ADSCs与β-磷酸三钙(β-TCP)的复合支架，并植入猪膝关节软骨缺损部位，观察其对软骨缺损组织CollagenⅡ、Sox-9表达的影响，以期为膝关节软骨缺损的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 巴马小型仔猪19只，2日龄，雌雄不限，由沈阳军区总医院动物医学实验科提供。Ⅰ型胶原酶购于美国Sigma公司，DMEM/F12培养基、FBS、胰蛋白酶、青链霉素均购于美国Hyclone公司，反转录试剂盒购于日本TAKARA公司，荧光定量试剂盒购于北京天根生化科技有限公司。

1.2 ADSCs分离及鉴定

1.2.1 ADSCs分离 随机选择1只仔猪处死。无菌条件下切开仔猪颈部，取颈部皮下脂肪组织5 g，用Hanks′液浸泡冲洗3次；使用医用眼科剪刀将脂肪组织上的肌肉和血管剔除，将脂肪组织剪成泥状。加入0.1%Ⅰ型胶原酶转入15 mL离心管中，放入CO2培养箱中消化90 min，消化期间不时振荡离心管，使其充分消化。将消化液过200目细胞筛，取滤液，3 000 r/min离心10 min。离心后弃去漂浮在离心管上面的脂肪细胞和上清液，用含10% FBS的DMEM/F12培养基将离心管下面的细胞吹打均匀，以1×105个/mL接种于培养皿中，10% FBS的DMEM/F12培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养。光镜下观察细胞生长情况。结果显示分离提取的未贴壁的ADSCs初期为圆形单个细胞，细胞边缘比较清楚，细胞贴壁生长后分布均匀(见插页Ⅰ图1A、B)。

1.2.2 ADSCs鉴定 采用免疫组化法。取第3代ADSCs，以1×105个/孔接种于24孔板中。将盖玻片放入细胞培养板中，待细胞爬片生长至70%～90%融合时，PBS洗3次；无水乙醇脱水，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗4 ℃孵育1 h，行免疫组化染色；镜下观察染色成功后用PBS冲洗，封片镜检。镜下观察ADSCs表型CD44、CD105的染色情况，以细胞染色呈棕黄色定义为阳性。免疫组化染色显示分离的细胞CD44和CD105表达均为阳性，证明其为ADSCs(见插页Ⅰ图1C、D)。

1.3 ADSCs和β-TCP复合支架制备及成骨诱导鉴定

1.3.1 成骨诱导及复合支架制备 以β-TCP作为支架材料，将其制成直径10 mm、高4 mm的圆柱体，共12个。随机选择其中6个进行成骨诱导：参照黄宏等[4]的方法配制成骨诱导剂，在支架中添加成骨诱导剂至支架充分浸泡，预冷后放入冻干机进行冷冻干燥。另外6个圆柱体支架材料不进行成骨诱导。所有支架在应用前采用培养基浸泡过夜，将预湿的支架置于24孔板中，每孔1个支架，共8个复孔。取传到第3代的ADSCs，0.25%胰蛋白酶消化后调整细胞密度为1×107个/mL，用微量加样器将100 μL ADSCs悬液逐滴滴加在支架的中心部位。将孔板放入孵箱中37 ℃孵育2 h，使细胞充分扩散到支架上。取1 mL基础培养基填满每个孔，置于37 ℃、5% CO2孵箱中进行复合培养，培养3周完成复合支架的制备。

1.3.2 成骨诱导鉴定 取经成骨诱导后复合支架上的ADSCs，分成两个培养皿进行培养。其中一个培养皿培养15天左右，镜下观察产生钙结节后参照茜素红染色试剂盒说明进行染色、封片；另一个培养皿参照碱性磷酸酶染色试剂盒说明进行染色、封片。在生物显微镜下观察，茜素红染色后钙结节呈红色定义为阳性，碱性磷酸酶染色后细胞核呈蓝色定义为阳性。结果显示经成骨诱导后复合支架上的ADSCs碱性磷酸酶和茜素红染色均为阳性，证明成功将ADSCs诱导为成骨细胞(见插页Ⅰ图1E、F)。

1.4 复合支架对猪膝关节软骨缺损组织CollagenⅡ、Sox-9表达影响的观察

1.4.1 造模与分组处理 将剩余18只巴马小型仔猪交由黑龙江省双鸭山市科技小型猪养殖场饲养至6月龄，体质量20～25 kg。将其随机分为空白对照组、支架组、成骨诱导支架组，每组6只。支架组、成骨诱导支架组取仰卧位，由耳浅表静脉注入氯胺酮溶液10 mg/kg。取膝关节正中切口，由髌骨内侧进入关节腔，显露关节软骨，分别在内、外髁用空心钻制作一个直径10 mm、深4 mm的圆柱形软骨缺损区，深达软骨下骨，建立膝关节软骨缺损模型。支架组植入未经成骨诱导的复合支架，成骨诱导支架组植入经成骨诱导的复合支架，植入后进行缝合。空白对照组切开膝关节后直接缝合，不进行其他处理。各组常规饲养4周后处死，取损伤处软骨组织进行以下实验。

1.4.2 软骨组织CollagenⅡ mRNA及Sox-9 mRNA表达 采用荧光定量PCR法。取软骨组织放入液氮中进行研磨，加入TRIzol试剂，提取总RNA。根据反转录试剂盒说明书进行反转录，条件为37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。CollagenⅡ上游引物：5′-TCCCCGGCACTCCTGGCACTGAT-3′，下游引物：5′-CTTGGGCACCTCGGGCTCCTTTAG-3′，片段长度136 bp；Sox-9上游引物：5′-GCCCTGTGTCTAAGAAGAGA-3′，下游引物：5′-AAAACAGAGAACGAAACCAG -3′，片段长度168 bp。以β-actin为内参，上游引物：5′-GAACCCTAAGGCCAACCGTG-3′，下游引物：5′-AGGCATACAGGGACAACACAGC-3′，片段长度145 bp。反应体系25 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，变性、退火和延伸共40个循环，72 ℃延伸5 min。以2-ΔΔCt法计算CollagenⅡ mRNA和Sox-9 mRNA相对表达量。

1.4.3 软骨组织CollagenⅡ蛋白及Sox-9蛋白表达 采用Western blotting法。采用匀浆机将软骨组织制成匀浆，加入蛋白裂解液，12 000 r/min离心5 min，吸取上清液，放入酶标仪中，根据试剂盒说明书绘制标准曲线。对所提取的蛋白进行定量和垂直电泳，70 V电压使蛋白跑到分离胶与浓缩胶界面处，将电压改为100 V，使胶体内的蓝色条带跑至分离胶底部时，完成电泳。湿转法转印，加入一抗于4 ℃环境中孵育过夜，加入二抗室温孵育，显影定影，拍照。以β-actin为内参，采用ImageJ软件进行灰度值分析。以目的蛋白和β-actin灰度值的比值计算CollagenⅡ蛋白和及Sox-9蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组软骨组织CollagenⅡ mRNA及Sox-9 mRNA相对表达量比较 与空白对照组比较，支架组和成骨诱导支架组软骨组织CollagenⅡ mRNA及Sox-9 mRNA相对表达量均降低，但支架组降低更明显(P均<0.05)。见表1。

表1 各组软骨组织CollagenⅡ mRNA及Sox-9 mRNA 相对表达量比较±s)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与支架组比较，#P<0.05。

2.2 各组软骨组织CollagenⅡ蛋白及Sox-9 蛋白相对表达量比较 与空白对照组比较，支架组和成骨诱导支架组软骨组织CollagenⅡ蛋白及Sox-9蛋白相对表达量均降低，但支架组降低更明显(P均<0.05)。见表2。

表2 各组软骨组织CollagenⅡ蛋白及Sox-9 蛋白 相对表达量比较±s)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与支架组比较，#P<0.05。

3 讨论

脂肪组织是主要的能量代谢场所之一，几乎遍布于动物全身，在整个生命过程中有极强的可塑性；不仅是能量储存库，还能分泌多种因子，可通过内分泌和旁分泌途径发挥调控作用[5,6]。近年来，复合支架逐渐应用于骨科疾病的治疗，并获得较好疗效。应用于复合支架的种子细胞应具备以下条件：①具有特定的分化表型或定向分化潜能；②可靠的细胞来源；③不引发移植排斥反应。ADSCs是从脂肪组织中分离得到的，不仅来源丰富，对患者损伤较小，易于从自身获取，而且符合种子细胞的相关要求。

目前研究已证实，ADSCs与骨髓基质的间充质干细胞(MSCs)不仅具有相同的表面黏附因子和受体分子，同样也能分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和成肌细胞。ADSCs有可能替代MSCs成为组织工程种子细胞的新来源[7]。研究发现，Sox-9基因过表达能抑制软骨细胞继续肥大并骨化，从而获得丰富且稳定存在的软骨组织。体外动物实验结果表明，Sox-9基因转染后的MSCs发生了软骨细胞方向的分化，部分动物实验证实转染后的MSCs形成了新的软骨组织，并能在体内长期存在[8～10]。软骨细胞基质中最多的CollagenⅡ能维持其基本形态，且CollagenⅡ能够促进软骨细胞分泌糖胺多糖及细胞因子[11,12]。

近年来研究证实，ADSCs与同样来源于中胚层的MSCs比较，在干细胞产量、生长动力学、细胞衰老、多向分化潜能及转染外源基因效率上无显著差异[13～15]。有研究将ADSCs复合在可缓释诱导因子Ⅰ型胶原海绵支架上，并将其移植修复软骨缺损组织，患者术后4个月软骨缺损部位完全修复，并形成透明软骨组织[16]。本研究成功分离得到ADSCs，并通过其表型CD44和CD105阳性得到鉴定；同时经成骨诱导后复合支架上的ADSCs碱性磷酸酶和茜素红染色均为阳性，证明成功将ADSCs诱导成为成骨细胞。同时本研究结果显示，与空白对照组比较，支架组和成骨诱导支架组软骨组织CollagenⅡ mRNA、Sox-9 mRNA及其蛋白相对表达量均降低，但支架组降低更明显。说明经成骨诱导后的ADSCs和β-TCP复合支架可提高猪膝关节软骨缺损组织CollagenⅡ和Sox-9表达，对软骨损伤具有促进愈合的作用。

综上所述，本研究成功制备了ADSCs和β-TCP的复合支架；该支架经成骨诱导后可提高猪膝关节软骨缺损组织CollagenⅡ和Sox-9的表达。本研究为ADSCs和β-TCP复合支架治疗膝关节软骨缺损提供了新的方向，但观察时间比较短，未来需延长观察时间并进行长期随访，进一步验证其治疗效果。

[1] Mashhadikhan M, Soleimani M, Parivar K, et al. ADSCs on PLLA/PCL hybrid nanoscaffold and gelatin modification: cytocompatibility and mechanical properties[J]. Avicenna J Med Biotechnol, 2015,7(1):32-38.

[2] 杜明昌,刘宪民,祖启明,等.自体脂肪干细胞复合不同初始浓度诱导支架修复猪膝关节软骨缺损的初步观察[J].中华临床医师杂志,2013,7(6):2523-2527.

[3] 刘宪民,杜明昌,刘松波,等.一期获取自体脂肪干细胞复合可缓释诱导因子支架修复猪膝关节软骨缺损的初步研究[J].中华创伤骨科杂志,2012,14(7):608-613.

[4] 黄宏,朱方强,王正国,等.脂肪来源干细胞体外成骨诱导和成脂诱导分化[J].第三军医大学学报，2014,30(13)：1129-1123.

[5] Zhou L, Xia J, Qiu X, et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis[J]. PLoS One, 2015,10(2):e0117644.

[6] Shukla L, Morrison WA, Shayan R. Adipose-derived stem cells in radiotherapy injury: a new frontier[J]. Front Surg, 2015,28(2):1.

[7] Koz′ lik M, Wójcicki P. The use of stem cells in plastic and reconstructive surgery[J]. Adv Clin Exp Med, 2014,23(6):1011-1017.

[8] 袁哲,裴新红,马瑞雪.Sox9 促进间充质干细胞向软骨分化的研究进展[J].医学信息,2014,27(3):564-565.

[9] Ham O, Song BW, Lee SY, et al. The role of microRNA -23b in the differentiation of MSC into chondrocyte by targeting protein kinase a signaling[J]. Biomaterials, 2012,33(18):4500-4507.

[10] Kanazawa T, Furumatsu T, Hachioji M, et al. Mechanical stretch enhances COL2A1 expression on chromatin by inducing SOX9 nuclear translocalization in inner meniscus cells[J]. J Orthop Res, 2012,30(3):468-474.

[11] Qi WN, Scully SP. Extracelluar collagen regulates expressionof transforming growth factorth factor-betal gene[J]. J OrthopRes, 2000,18(6):928-932.

[12] Tew SR, Murdoch AD, Rauchenberg RP, et al. Cellular methodsin cartilage research: primary human chondrocytes in cultureand chondrogenesis in human bone marrow stem cells[J]. Methods, 2008,45(1):2-9.

[13] García-Contreras M, Vera-Donoso CD, Hernández-Andreu JM, et al. Therapeutic potential of human adipose-derived stem cells (ADSCs) from cancer patients: a pilot study[J]. PLoS One, 2014,9(11):e113288.

[14] Ueda T, Fujita A, Ogawa R, et al. Adipose-derived stromal cells grown on a hydroxyapatite scaffold can support hematopoiesis in regenerated bone marrow in vivo[J]. Cell Biol Int, 2014,38(6):790-798.

[15] Zhang Y, Yu M, Tian W. Physiological and pathological impact of exosomes of adipose tissue[J]. Cell Prolif, 2015,49(1):3-13.

[16] 刘宪民,杜明昌,柳椰,等.猪膝关节软骨全层缺损、软骨下骨损伤后滑液中炎性因子水平变化[J].创伤与急危重病医学2015,3(1):9-12.

Preparation of ADSCs composite scaffold and its effect on CollagenⅡ and Sox-9 expression in pigs with knee articular cartilage defects

WANGYu,WANGQi,DUMingchang,LIUMing,LIUXinwei,ZHANGYubiao,LIUSongbo,LIUXianmin,XIANGLiangbi

(GeneralHospitalofShenyangMilitaryAreaCommandofChinesePLA,Shenyang110016,China)

Objective To prepare the composite scaffold of porcine adipose stem cells (ADSCs) and β-tricalcium phosphate (β-TCP), and then to observe its effect on CollagenⅡ and Sox-9 expression in pigs with articular cartilage defects. Methods The ADSCs were extracted from subcutaneous adipose tissues of one Bama miniature pig, cells were observed under microscopy, and the expression of CD44, CD105 was detected by immunohistochemical staining. We took β-TCP as scaffolds to make 12 cylindrical stents, then 6 of which were randomly selected for osteogenic induction. The 12 stents and ADSCs were co-cultured to prepare the ADSCs composite scaffolds. ADSCs after osteogenic induction received the Alizarin red and alkaline phosphatase staining. Eighteen Bama miniature pigs were randomly divided into the control group, the stent group and osteogenic stent group, 6 in each. The knee cartilage defect models matched to stent size were prepared in the stent group and osteogenic stent group, then were implanted into the ADSCs composite scaffolds with or without osteogenic induction. In the control group, we directly sutured the incision after knee cut without any other treatment. The pigs were sacrificed after four-week regular feeding in each group, and we took the cartilage lesions. The fluorogenic quantitative PCR and Western blotting was used to detect the mRNA and protein expression of CollagenⅡ and Sox-9 in the cartilage tissues. Results Under microscope, ADSCs in the early separation were circular single cells, and the cell edge was more clear, and adherent cells formed uniformly. Immunohistochemical staining showed that CD44 and CD105 expression was positive in the isolated cells, which demonstrated they were ADSCs. Compared with the control group, the mRNA and protein expression levels of CollagenⅡ and Sox-9 were decreased in the stent group and osteogenic stent group, but the decrease was more significant in the stent group (allP<0.05). Conclusion ADSCs and β-TCP material composite scaffold was successfully prepared, and the scaffold after osteogenic induction can increase the expression of CollagenⅡ and Sox-9 in pig knee cartilage defect tissues.

cartilage defects; knee; subchondral bone; β-trical ciun phosphate; adipose stem cells; scaffold; swine

辽宁省自然科学基金资助项目(2013020175)；辽宁省科技攻关项目(2013225089)。

王宇(1983-)，男，主治医师，研究方向为运动关节疾病。E-mail: luzongguke@163.com

刘宪民(1954-)，男，主任医师，研究方向为运动关节疾病。E-mail: Surgeon_du@yahoo.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.001

R687.3

A

1002-266X(2016)32-0001-04

2015-12-14)